引言：方法开发是个复杂而又神秘的工程，往往需要扎实的理论知识储备，但同时也少不了经验的积累；对于方法开发，需要我们从多学科出发，分析仪器学、色谱学、药学、有机化学、分析化学等学科综合，也需要我们熟练掌握文献信息检索，从中吸取精华，同时不断去试错，下面就把我个人职业生涯的经验进行总结提炼，供同行一起学习探讨，有不足之处需要同行前辈予以指正。
一、确认开发工作内容
1.残留溶剂检测分析方法：GC-HS方法、GC直接进样方法
2.基因毒杂质检测分析方法
3.高沸点样品杂质分离与含量检测方法
二、信息收集
1.首先要确定待测物质的溶解性、极性、沸点，主要针对“溶剂残留”；
2.其次还需要确定样品的溶解性、热稳定性、极性、沸点、化学性质（酸碱）、物理属性（固体/液体/半固态）。
三、色谱柱使用选择指南（分离关键）
四、进样方法的选择
1.方法有：溶液直接进样法、顶空进样
①残留溶剂-HS：大多数是低沸点物质（醇/酯/烷烃/醚），90%以上采用顶空进样（GC-HS），清洁进样，基本不出杂峰（溶剂），原料不被破坏但经济费用高。
②残留溶剂-DS：5%及少数采用溶液直接进样（GC-DS），经济，但出杂峰多（主要原料破坏带入），易损坏色谱柱需清洁老化保护。
③开发选择考虑总结：
2.溶剂沸点过高（沸点大于180℃），且样品对热比较稳定首选溶液直接进样法；
3.溶剂沸点低（沸点小于150℃），且样品对热不稳定首选顶空进样法；
4.顶空进样法可消除因溶液直接进样会产生降解杂质峰而干扰目标峰（进样口温度大于200℃），采用顶空进样方法还可以减少对样品的预处理。
5.基因毒杂质方法开发，优先选择溶液直接进样法（限度低，主要考虑提高灵敏度）；样品杂质分离选择使用溶液直接进样法。
6.对于基因毒杂质限度小于2ppm以下方法开发，优先选择GC-MS溶液直接进样法。
五、确定定量方法
1.外标法：残留溶剂、含量（准确）
2.内标法：残留溶剂（主要针对易挥发烷烃类）
3.面积归一化法：样品杂质分离及纯度
六、样品预处理方法
1.气相色谱仪能直接分析的样品通常是气体或液体，固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中，而且还要保证样品中不含GC不能分析的组分（如无机盐：进样口温度不能保证盐汽化），往往会聚集在进样口衬管或分流平板导致污染/堵塞，还有可能通过载气进入色谱柱中，损坏色谱柱的填料。
2.样品预处理/溶解原则：根据相似相溶原理。
3.样品分类：气体样品、液体样品、固体样品。
4.气体/液体样品预处理方法：
①直接进样分析（纯度分析与检测），如：甲烷、乙醇；
②脂溶性液体样品（杂质），通常需要用脂溶性有机溶剂溶解样品，如：甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、DMSO、DMF；
③进样方式：溶液直接进样、顶空进样。
5.固体样品（含盐）样品预处理方法：
①样品性质：易溶于水，难溶于有机溶剂，样品熔点高，难汽化，如：钠盐/钾盐/盐酸盐/硫酸盐/磷酸盐/富马酸盐；
②如果选择水作溶剂-尽量使用顶空进样方法；
③灵敏度不理想且限度低（1-10ppm）-可使用水溶解二氯甲烷/正己烷萃取法来进行预处理样品，这样既可以溶液直接进样又可以顶空进样，检测杂质/残留/基因毒通用。
七、溶剂系统选择
1.如果是溶液直接进样法，优先考虑溶剂选择，溶解样品的溶剂和最大溶解限度；如果是顶空进样法，可根据样品和溶剂都能溶解；
2.原则上水溶性样品优先选择水，非水溶性样品可选择酯/醇、DMF、DMSO、NMP、DMAC；
3.溶液直接进样-样品溶剂选择考虑：
①化学稳定（水解/醇解），优先选择水（水溶性）/醇/酯（脂溶性）作为溶剂；反之选择烷烃、质子溶剂（万能溶剂：DMF、DMSO、NMP、DMAC）；
②样品具有酸/碱性，但是检测残留溶剂或杂质也具备酸/碱性，可根据待测物质酸/碱性质选择酸碱中和样品；如盐酸/硫酸/富马酸盐等产品检测胺类，需要单独使用碱性溶剂进行中和解离，同样反之，如吡啶/钠/钾盐等产品检测酸类，需要单独使用酸性溶剂进行中和解离（具体溶剂选择，需要进行加标回收验证实验）。
③供试品溶液要澄清，不与样品及待测物质反应或结合。
4.顶空进样-样品溶剂选择考虑：
①化学稳定（水解/醇解），优先选择水（水溶性）作为溶剂；反之选择质子溶剂（万能溶剂：DMF、DMSO、NMP、DMAC）；
②样品具有酸/碱性，同上“3.②”。
③样品溶解完全没要求,顶空进样气体（溶剂残留）。
5.对于低限度燃烧值大的物质，可选用盐析溶剂系统，如：苯残留、三氯甲烷。
6.样品溶解溶剂选择，也要考虑残留溶剂的溶解度（如：烷、醚类不溶解水）。
7.大部分溶剂系统优先选择DMSO、NMP、DMF，因为既能溶解样品又能溶解溶剂。
八、柱温开发研究
1.等温：对于溶剂个数小（1-3个），且各溶剂沸点差异不算很大，此时可选择等温法，比如50℃保持10-15分钟（适合残留溶剂检测、基因毒杂质检测、含量测定）；
2.程序升温：对于溶剂个数多（大于5个），且各溶剂沸点差异较大，此时可选择程序升温法，比如40℃保持10分钟，以10℃/min速率升至180℃，保持5分钟（适用于产品杂质分离、残留溶剂检测）；
3.极端分离：对于大部分沸点低溶剂（当使用DB-624）且考虑分析时长时，可选用低温程序升温法，比如初始35-40℃（分析环境一定要保证＜25℃）；
4.经典程序升温（残留溶剂、杂质分离）：
九、顶空条件方法选择和研究
1.炉温（加热-顶空瓶平衡温度）：
①以水为溶剂，温度选择范围75-90℃，最高选择90℃；
②以DMSO、DMF等为溶剂，温度选择范围80-145℃，最高选择140℃；温度过高要考虑高温时长导致溶剂反应降解产生新的未知杂峰；
③考虑温度过高有爆瓶危险，特别在使用盐析方法时（因为溶剂系统里水分存在）爆瓶概率增加；
④加热温度研究最高温度一般低于溶剂10℃（在考虑灵敏度情况下）。
2.定量环温度：温度要大于炉温10℃；
3.传输线温度：温度要大于定量环温度10℃；
4.顶空瓶（加热）平衡时间：根据大部分溶剂沸点，沸点都相对高平衡时间就长，沸点相当都低平衡时间就短；常规平衡时间为30-60分钟，经典平衡时间为30分钟。
十、检测器选用
1.90%分析方法工作优先选用FID检测器：含碳氢化合物
2.基因毒杂质选用FID-MS检测器
3.如含电负性基团（F/Cl/Br）且含CH量少，选用ECD电子捕获检测器，如三氯甲烷无H物质
4.含有非碳氢化合物组分时，且对检测灵敏度要求不高，通常选择TCD检测器，主要气体检测，如辅材：氮气
十一、方法建立
1.进样口温度：一般选择200-230℃，进样口温度要大于传输线温度，可根据样品性质研究选用中高温，如150-180℃（考虑样品不被热解）；
2.检测器温度：一般230-260℃。检测器温度要大于进样口和色谱柱温度；
3.流速：3.0-5.0mL/min，经典流速为：4和5mL/min；
4.分流比：①5:1-50:1；②选择规则-响应值高大分流比，反之则小分流比；③经典分流比为5:1（顶空进样）和50：1（溶液直接进样）；
5.进样量：顶空进样-1mL，溶液直接进样-0.2-1uL，也可根据进样峰型进行改进；
6.样品浓度/配制开发研究：
①顶空进样：0.2-1g（根据限度/灵敏度要求进行研究），对于大浓度要考察样品提取平衡；浓度一般控制在0.1-0.4g/mL（顶空装量控制在1-5mL）；
②溶液直接进样：一定要考虑溶解完全，浓度可根据限度/灵敏度要求进行开发研究；一般控制在0.5-200mg/mL；
③开发研究合适的样品浓度，一定要根据杂质限度/灵敏度做相应研究调整。
7.对于杂质分离（溶液直接进样法），在方法开发同时也要考察残留问题，可增加清洗老化色谱柱方法程序，也可增加清洗进样针方法；还有对于对气相管路有吸附残留性质也可增加清洗程序（如胺类、＞150℃高沸点物质），增加程序一定要作为分析方法的一部分，且一定要经过验证验收。
8.系统干扰考察研究：先走空白2针，样品1针、对照1针，查看空白、样品溶液的干扰情况，空白与样品应无干扰峰出现（方法验证-专属性），且对LOQ和LOD测试无干扰，基本能通过LOQ和LOD验证（方法好坏体现在系统与溶剂对测试的干扰）；
9.最后进行100%加标回收测试，回收结果如果满足90%-105%，方法基本确定。
十二、分析方法评价
1.分析方法开发评价标准：
①空白考察：空白溶液无干扰峰出现，应该对测试无影响（最小干扰＜LOD）；
②分离度：最低分离度标准为，各相邻峰间分离度＞2.0（最小1.5）；
③LOQ：确认灵敏度（响应值）最小的2个，将LOQ试验出来，LOQ对应浓度是否合格（LOQ含量不得高于限度的50%），且LOQ的S/N要大于10；
④加标回收标准（90-110%）；
⑤溶液稳定性：100%加标溶液考察0、2、4、8、24小时的稳定性，主要考察峰面积RSD%（n=5）以及各溶剂的回收率%。
结语：干一行爱一行！冰冻三尺非一日之寒！需要我们不断学习探究，不断去实践不断扎实自己，对GC方法开发同时也需要我们扎实的仪器分析基本功，对GC色谱理论知识的剖析和挖掘，更要我们对GC仪器的熟练操作能力，这样我们的工作会事半功倍。
2025-06-08
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