mRNA药物具有开发周期短、生产速度快的优势，其开发过程可以概括为质粒DNA的制备、线性化DNA模板的制备和纯化、体外转录（In Vitro Transcription, IVT）、mRNA纯化和脂质纳米颗粒（Lipid Nano Particle, LNP）包封，而分析方法开发和质量控制伴随mRNA药物的整个生命周期。

图1 mRNA工艺流程和分析^[1]

2023年4月，USP针对mRNA疫苗发布了第二版《Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality-Draft guidelines: 2nd Edition》，基于质量源于设计（QbD）的概念，将表征和放行测试分为三个主要阶段：质粒DNA模板、mRNA原液和mRNA-LNP成品。以下将针对这三个阶段的表征和放行测试展开进行阐释。

1. 质粒DNA模板

质粒DNA一般具有三种基本形态，包括超螺旋（Supercoiled, SC）、开环（Open Circular, OC）、线性化（Linear, L），而每种形态又有多种聚合形式。其中，超螺旋形态被认为是高质量的起始材料，在基因质粒和DNA疫苗的研究中也对药用质粒的超螺旋含量做了明确要求（FDA要求>80%，NMPA要求≥90%，SMPA要求＞85%）。

目前，常见的质粒超螺旋检测方法有琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis, AGE）、毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis, CGE）和阴离子交换-高效液相色谱（Anion-Exchange-HPLC，AEX-HPLC）。AGE具有成本低、通量大、速度快的优点，通常会用在工艺过程检测中，但其局限在于开环质粒和超螺旋二聚体通常无法分离，因此需要在需要进行准确定量时CGE或HPLC是更好的选择（图2）。

图2 质粒超螺旋纯度检测方法图例

除超螺旋纯度外，质粒的放行质控项目还包括：外观、pH、鉴别、浓度/纯度、HCD等残留检测及安全性检测。

表1 质粒放行质控项目

2. mRNA原液

质粒DNA经过限制性酶切后得到线性化质粒，纯化后的线性化质粒可以作为体外转录的模板，其纯度会直接影响体外转录mRNA的质量，因此线性化效率也是在工艺过程必须检测的质量指标，可使用HPLC或CGE检测。

体外转录得到的mRNA经过纯化得到mRNA 原液（Drug Substance, DS），其关键质量属性包括加帽率、polyA等。

表2  mRNA放行及表征检项

5'端m7G帽子对mRNA免疫原性和稳定性至关重要，并直接影响mRNA的翻译效率，因此加帽率是mRNA的关键质量属性（Critical Quality Attribute, CQA）之一。目前常用的加帽率检测经典方法是生物素标记的探针联用RNaseH法，探针与mRNA形成杂交链后，引导RNase H在特定位置切割，得到较短的5’ mRNA片段，使用链霉亲和素磁珠纯化后产物可借助离子对反相色谱（Ion-Pair Reverse Phase，IP-RP）联用质谱（Mass Spectrum, MS）法或离子对反相高效液相色谱法进行分析定量，从而计算出加帽片段的百分比^[2]。随着mRNA药物的发展，更多的工具酶正在被引入到加帽率的质量控制中，如核酶^[3]、RNase 4等。

图3 加帽率质谱检测图（IP-RP-LCMS）

图4 加帽率液相检测结果（IP-RP-HPLC）

3' polyA尾也对mRNA的翻译效率有显著影响，其检测方法与加帽率原理类似，也是使用工具酶酶切后纯化得到3’mRNA片段，使用质谱、液相或毛细管电泳仪进行分析，健新原力分析平台配备这三大基础设备，可实现polyA的单碱基分辨率分析。

图5  3'polyA检测图（A: MS; B: CGE）

3. mRNA-LNP成品

脂质纳米颗粒是mRNA药物常用的递送系统，通常有多种脂质组成，包括在特定环境下产生正电荷的可电离脂质，电离后可以与带负电荷的mRNA通过静电作用紧密结合；负责稳定纳米颗粒结构的聚乙二醇脂质；负责填充纳米颗粒结构的磷脂和胆固醇脂质。

mRNA-LNP是mRNA药物的成品（Drug Product），其放行及表征检项除了一般检查和安全性相关检测之外还包括粒径、多分散系数（Poly Dispersity Index, PDI）、脂质含量、包封率等（表3）。

表3  mRNA-LNP放行及表征检项

粒径和PDI直接影响纳米分散体系的物理稳定性，是评价LNP体系的一项重要指标，通常使用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）进行粒径和PDI的检测。DLS的检测原理是通过激光照射溶液体系中的存在布朗运动纳米粒子，分析散射光光强的波动，从而计算得到纳米粒子的粒径。

图6 DLS检测粒径图

由于大多数脂质成分没有紫外吸收，因此在脂质含量检测中通常使用电喷雾式检测器（Charged Aerosol Detector, CAD）^[4]。CAD是一种新型通用型检测器，具有灵敏度高、重现性好的优点，能准确用于定量或半定量分析，也是USP 第二版mRNA分析方法指南草案中明确推荐使用的检测器。健新原力分析平台已建立通用的HPLC-CAD检测方法，且已经过重复性、准确度等考察，可用于各种LNP组分的鉴别和定量。

图7 mRNA-LNP脂质含量检测重复性图

包封率表示包封在纳米脂质颗粒内的mRNA占总mRNA的比例，是mRNA-LNP制备的重要质控指标。目前检测包封率的方法主要是微孔板荧光定量法，使用RNA染料（如RiboGreen）分别测定mRNA-LNP中游离RNA浓度和经过Triton X-100破坏LNP结构后溶液中全部的RNA浓度即可计算出包封率。

图8 LNP包封率检测标准曲线

结语

mRNA药物的应用方向已经从传染病疫苗逐渐延伸到肿瘤疫苗、蛋白替代疗法、基因编辑技术等方面，表现出了巨大的潜力和商业前景。而其优势之一就是开发周期短、生产速度快，也正因为此，平台的经验储备也成为加速药物开发的关键。健新原力分析平台已经具备mRNA-LNP分析的配套成熟平台方法，能够及时响应药物开发速度和质量的需求，为mRNA-LNP的全生命周期保驾护航。

参考文献

[1] Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality-Draft guidelines: 2nd Edition.

[2] Beverly M, Dell A, Parmar P, Houghton L. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2016 Jul;408(18):5021-30.

[3] Vlatkovic I, Ludwig J, Boros G, Szabó GT, Reichert J, Buff M, Baiersdörfer M, Reinholz J, Mahiny AJ, Şahin U, Karikó K. Ribozyme Assays to Quantify the Capping Efficiency of In Vitro-Transcribed mRNA. Pharmaceutics. 2022 Jan 29;14(2):328.

[4] Kinsey C, Lu T, Deiss A, Vuolo K, Klein L, Rustandi RR, Loughney JW. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. 2022 May;43(9-10):1091-1100.