注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。

上篇文章中我们对mRNA的序列进行了深度的解析，包括mRNA的组成元件：5'帽结构（Cap）、5'非翻译区（UTR）、编码区（CDS）、3'非翻译区（UTR）和poly（A）尾巴。同时，我们汇总了通用的mRNA序列优化策略，以获得结构稳定、翻译效率高的mRNA序列。点击链接即可查看详情：【耀文解读】深度解析mRNA序列元件：Cap, CDS, UTR, polyA

mRNA 原液生产工艺大致可分为 3个单元：体外转录（IVT）、mRNA 纯化、除菌过滤。

图1: mRNA生产路线图

一、mRNA原液生产

以线性化质粒为模板，通过体外转录（IVT）能够高效合成1~10 kb长度的mRNA。出于高特异性和转录活性的考虑，mRNA工艺生产中最常用的RNA聚合酶是源自T7噬菌体的RNA聚合酶。RNA聚合酶来源除T7噬菌体外，还有T3噬菌体和SP6噬菌体。不同来源、不同类型的RNA聚合酶识别的启动子序列是不同的。T7 RNA聚合酶识别T7启动子序列，启动转录反应。最广泛使用的T7启动子序列为TAATACGACTCACTATA。质粒序列设计时，mRNA的5’端序列5'UTR位于T7启动子序列后面。

IVT反应体系通常由转录缓冲液、线性化质粒模板、4种类型的三磷酸核糖核苷酸（含修饰核苷酸）、RNA聚合酶、焦磷酸酶与RNase抑制剂组成。共转录加帽策略中，还需在IVT体系中添加帽类似物。转录缓冲液包含Tris-HCL缓冲液、醋酸镁、二硫苏糖醇（DTT）、亚精胺以及Triton-X100等组分。

IVT工艺需考察的一个重要指标是mRNA的产量。不同成分及其浓度可能影响mRNA的产量，过低或者过高的镁离子浓度会抑制 mRNA 的合成。类似地，IVT 体系中过高或者过低的 NTP 也会严重抑制 mRNA 生成。有研究报道，组合优化NTPs浓度和镁离子浓度，可以得到较高的mRNA产量。一般情况下，在一定的浓度范围内，随着质粒模板量的增加，特定时间点的mRNA 产量有所增加。但是，质粒浓度增加并不会提升 mRNA 的终产量，只是会加快 mRNA的合成速率。造成以上现象的原因是，mRNA的合成是以质粒作为模板，模板含量决定了特定时间内的 mRNA 产量，但不会影响无限合成时间内的mRNA终产量。

图2: IVT过程dsRNA形成的2种机制

图3: 用于IVT的不锈钢反应器和一次性反应器

mRNA纯化即去除IVT反应液中的杂质，得到一定纯度的mRNA原液。

图4: IVT反应液中的工艺相关残留和产品相关残留

基于mRNA产物与反应液中各种残留物质的理化性质差异，比如电荷性、分子量、疏水性等设计纯化方案，以去除目标杂质，即可得到高纯度的mRNA。在目前已经公开的方法中，IVT反应后添加DNase去除DNA，后续的常规工艺路线为：TFF1+层析纯化+TFF2。

第一次进行切向流过滤（TFF）的目的是换液，将mRNA从IVT反应液中置换到目标缓冲液中，例如纯水。这一过程我们选择适当的中空纤维孔径截留mRNA分子，酶、缓冲液成分、核苷酸、帽类似物等成分流穿。有专利建议，选择纯水稀释倍数为10。也就是说，如果IVT反应液体外为110L，那么需要用纯水将其稀释到1100L，再将其回流终体积设定为110L，透过端液体为990L，其他参数包括膜面积和流速。

用于mRNA纯化的层析类型包括亲和色谱、疏水层析、离子交换层析、基于纤维素层析（去除dsRNA）以及复合层析等。目前oligo dT亲和层析是mRNA的主流纯化工艺，特异性结合带polyA尾巴的RNA。高盐浓度可以抑制携带负电荷的配体-RNA之间的排斥作用，促进RNA与柱子的结合。将盐浓度降低后，恢复柱子配体-RNA之间的负电荷之间的排斥作用，将RNA洗脱下来。

最后一步的TFF（切向流过滤）目的也是换液，去除层析缓冲液中的盐离子，同时对mRNA进行浓缩，使其达到符合要求的浓度标准。

图5: TFF（切向流过滤）系统

1.3 除菌过滤

除菌过滤是mRNA原液生产的最后一步。mRNA是一种生物活性物质，首选除菌方案是0.22μm滤膜过滤，去除细菌等微生物的同时保持mRNA的生物活性。除菌过滤后的mRNA原液处于无菌状态，利于mRNA原液稳定储存，用于随后的LNP包封工艺。

脂质纳米颗粒（LNP, lipid nanoparticle）是临床上最前沿的mRNA递送系统。截至目前，多数正在研发或获批临床的SARS-CoV-2 mRNA疫苗采用了LNP递送系统、或基于LNP的改良系统。LNP作为mRNA的递送载体有以下优点：制剂简单、模块化、生物相容性好，且具有较大的mRNA有效载荷容量。

在微流控技术下，一定配比的脂质组分和mRNA混合形成纳米颗粒药物。具体的生产工艺单元包括：配液、微流控包封、超滤换液、除菌过滤与无菌灌装。

除活性物质mRNA外，LNP通常包括四种脂质：可电离脂质（ionizable lipid）、胆固醇（cholesterol）、辅助磷脂（helper phospholipid）和聚乙二醇化脂质（PEGylated lipid）。

各脂质组分的功能介绍如下：可电离脂质体在生理pH下是中性的，在酸性条件下与mRNA形成纳米颗粒，脂质体带正电荷并吸引RNA。且在酸性环境下带正电荷，促进与细胞膜间的融合，并释放至细胞质。胆固醇通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，细胞吸收时有助于与内体膜融合。辅助性脂质通过促进脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并增强疗效，有助于膜与核内物质的融合。聚乙二醇化脂质由聚乙二醇（PEG）与锚定脂质（如DMPE或DMG）结合而成。亲水性PEG稳定LNP，通过限制脂质融合调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒的半衰期。

配液操作是对包封料液的预处理，涵盖水相和有机相。将mRNA溶解在某种缓冲液中，得到水相；将各个脂质组分混合溶解在乙醇中，得到有机相。

这一工艺单元涉及的参数如下：mRNA浓度、缓冲液组分、缓冲液pH、各脂质成分及比例、脂质浓度。以上参数需根据氮磷比、包封效率进行合理设计和优化。

微流控设备的工作原理为：将水相和有机相分别泵入制备系统的两个入口通道，在特定管路位置两相混合，mRNA被包封在LNP中，以单股流出。微流控设备会精确地控制两相的流速，来控制LNP的包封率、粒径、电荷等质量。

LNP包封操作单元涉及的参数包括：水相/有机相比例、水相流速、有机相流速。

图6: 微流控技术生产LNP-mRNA

随后一步的超滤换液可通过切向流过滤（TFF）实现，去除包封过程的有机溶剂等物质，同时对LNP-mRNA进行浓缩，并置换到特定处方缓冲液中，稳定储存。

这一单元的相关参数包含处方组成和工艺参数。处方组成包括缓冲液的组分、pH、保护剂成分和浓度等。TFF工艺参数包括切向流速、跨膜压（TMP）、滤液通量、剪切力等。

除菌过滤与无菌灌装是LNP-mRNA成品生产的最后一步，涵盖LNP-mRNA、及包材/工器具、注射用水与压缩空气的无菌处理。

溶解在目标处方中的LNP-mRNA经0.22μm滤膜过滤除菌，保持mRNA的生物活性。LNP-mRNA除菌过滤工序在符合GMP规范的C级洁净区完成。设备采用CIP/SIP系统进行清洗和灭菌，过滤系统使用前后进行在线完整性测试。

包材/工器具在自动化设备中清洗、干热/湿热或VHP灭菌，注射用水和压缩空气经0.22μm滤器过滤除菌。

药品及包材除菌后，经O-rabs系统 (可操作限制进入隔离系统) 进入A级洁净区，完成无菌灌装。

为解决疫苗、核酸药物、蛋白药物、抗体药等生物制品的无菌生产需求，耀海建立了符合GMP规范的无菌制剂生产车间，涵盖西林瓶、预灌封、卡式瓶等。耀海车间无菌灌装区域配置了在线悬浮粒子和沉降菌监测系统，采用臭氧和VHP进行消毒，灌装系统采用CIP/SIP进行清洗和灭菌，全方位避免人为干扰。详情可咨询：13380332910（微信同号）。

三、结论

mRNA工艺路线的不断升级成熟，无疑推动了各类mRNA疫苗/药物的开发进程，深刻地影响生物医药领域的格局。

平台性的mRNA原液和LNP-mRNA成品生产工艺包括mRNA 原液单元：体外转录（IVT）、mRNA 纯化、除菌过滤，和mRNA-LNP制剂生产工艺：mRNA与脂质配液、微流控包封、超滤换液、除菌过滤与无菌灌装。

基于在mRNA制备方面的开创技术和丰富经验，耀海生物可为全球客户提供mRNA一站式制备服务，涵盖mRNA小样制备、工艺开发、分析方法开发、LNP制剂开发、GMP生产。耀海生物还可提供各种预制型mRNA产品，编码蛋白涵盖报告基因、靶点蛋白、基因编辑蛋白和抗原蛋白，包括eGFP、mCHERRY、luciferase、IL-2、Cas9、OVA、新冠S蛋白等，以满足不同的实验或项目需求。详情可咨询：13380332910（微信同号）。

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Advancements of in vitro transcribed mRNA (IVT mRNA) to enable translation into the clinics. Adv Drug Deliv Rev. 2023 Aug;199:114961. doi: 10.1016/j.addr.2023.114961

【耀文解读】深度解析mRNA序列元件：Cap, CDS, UTR, polyA

Yaohai Bio-Service | 专业高效的无菌制剂生产服务概览

【星耀小课堂】重组疫苗篇：B群脑膜炎球菌重组蛋白疫苗盘点

耀海生物CDMO服务 | 菌种库构建服务

【耀文解读】行业共识|质粒生产用菌种库及质粒DNA的放行标准

耀海生物服务覆盖 “重组蛋白/疫苗，质粒/mRNA、纳米抗体”等领域pre-IND至临床Ⅲ期样品制备及商业化生产服务，致力于打造CRO/CDMO/MAH全方位，定制化一站式服务平台。拥有20000平符合GMP要求车间，3000平研发中心，针对客户需求提供50L-2000L定制化服务。相关资讯请联系官方客服耀菌君联系：13380332910（微信同号）