摘要: “酰基氯”是基因毒警示结构，在含有水、醇或胺类等物质环境中极不稳定，分析方法开发难度极大，采用衍生化后测定是一个不错的选择，但是衍生化试剂如何选择，非常关键，本文以氯磺酸异氰酸酯为例，展示分析方法开发全过程，不足和缺陷之处，望同行批评指正。
一、化合物性质
本品具有 “酰基氯”基因毒警示结构，易吸湿，在空气中形成烟雾，遇水剧烈反应生成氨基磺酸、氯化氢和二氧化碳。可溶于氯化烃、乙腈。沸点：107℃，分子量141.53。
“酰氯”在含有水、醇或胺类等物质环境中极不稳定。
二、衍生化试剂的选择
思路1，采用小分子醇与其进行衍生化生成酯，在通过GC-MS进行采集，衍生机理如下：
结果：本品分别与甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇反应，采用GC-MS进行检测，峰型良好，但方法灵敏度无法满足1ppm的限度要求。
图1：GC-MS谱图
思路2，进一步考虑选择含芳香集基团的醇或胺与其进行衍生，然后采用LC-MS/MS方式进行采集，衍生机理如下：
结果：采用氯磺酰异氰酸酯与苯胺衍生，以二氯甲烷为溶剂，产生的衍生物较多，以乙腈为溶剂（5%的甲醇助溶），产生的衍生物相对单一，便于定量，谱图如下所示：
图以二氯甲烷为溶剂的衍生化结果
图以乙腈为溶剂的衍生化结果
三、检测方法的优化
3.1、衍生化时间对产物的影响
氯磺酰异氰酸酯与苯胺反应立即生产白色固体并伴有白雾，快速反应，衍生时间考察5min，10min，20min。
结论：该反应快速，5min已完成全部反应，衍生时间的延长对衍生效果基本无影响。
3.2、衍生试剂用量对反应的影响
取氯磺酰异氰酸酯约30mg，分别加入不同体积的衍生化试剂进行反应，根据衍生化试剂的反应当量，分别加入1倍反应当量，2倍反应当量及3倍反应当量。
结论：随着衍生化试剂量的增加，衍生产物的量也随之增加，当加入量大于2倍理论量后，衍生产物的量基本不再增加，表明加入至少2倍理论量的衍生试剂时能保证衍生完全。
3.3、色谱条件的选择
根据上述条件，进一步进行色谱条件的优化：
条件一、流动相：10mmol甲酸铵水溶液（用甲酸调节pH值3.5）-乙腈（45:55），柱温30℃，流速0.3ml/min，进样量5μl，运行时间5min，色谱柱，C18色谱柱（2.1*150mm，3μm），质谱条件，电喷雾离子化源（ESI），多反应监测（MRM，290.2/170.9），离子源温度300℃，脱溶剂管温度250℃，雾化气流速（N2）3L/min，加热器流速15L/min，干燥器流速10L/min；CE电压13.0V。
条件二、多反应监测（MRM，290.2/78.06），其他同条件一
条件三、反应监测（MRM，290.2/92.10），其他同条件一
结论：多反应监测（MRM，290.2/170.9）条件下，方法灵敏度最高。
条件四、固定“多反应监测（MRM，290.2/170.9）”条件，CE电压分别设定为13V、15V及20V。
结论：不同碰撞电压，目标组分的响应差异不大，最终确定CE电压为13V。
条件五、对照品溶液配制方式的选择
采用加标回收率的考察方式，评估基质效应的影响，数据如下：
结论：根据上述结果可知，本方法测试具有基质效应，标准中拟定采用标准加入法。
四、方法预验证
对某原料中该杂质进行预验证，结果显示，本方法的专属性良好，灵敏度可以达到0.5ppm的定量，回收率在80%-120%之间，方法可行。
五、参考文献
[1]2020版《中国药典》通则 9101.
[2]ICHM7.
[3]衍生化法测定酰胺类基因毒警示结构杂质的综述.
2025-06-15
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