抗体药物偶联物（ADC）是将单克隆抗体和小分子化合物通过连接子结合的药物，有助于提高药物的靶向性、降低毒性。ADC有三个组成部分：抗体，负责靶向递送，有些抗体也可发挥治疗作用；有效载荷，发挥主要的疗效；连接子，连接有效载荷和抗体，应在血循环保持稳定并在靶组织处释放有效载荷（见图1）。
图1. 抗体药物偶联物（ADC）结构示意图
按ADC的设计原理，ADC药物在血液循环中将保持良好的稳定性，在到达靶组织后释放药物，以实现最大的治疗窗。实际情况可能存在ADC药物在血液循环系统稳定性仅维持数天，并在血浆中蛋白酶作用下，导致药物的缓慢释放。掌握药物释放的机制和游离药物释放程度有助于设计和优化获得性质更好的ADC作为临床前候选分子，开发出更安全有效的ADC药物。此外，ADC的分解代谢（如肽段片段或连接子-药物片段的生成）也会造成额外的药物抗体比（Drug antibody ratio，DAR）改变，并会增加ADC在循环系统的代谢和降解的复杂性；而通过化学反应和酶裂解的去偶联是ADC药物在血浆的常见释放机制。例如，经马来酰亚胺和二硫键连接形成的THIOMAB ADCs在血浆中会分别经马来酰亚胺和二硫键转换的方式去偶联，从而导致去偶联的半胱氨酸位点被循环系统的半胱氨酸和谷胱甘肽修饰（图2a）。同样的，特定的载荷在循环中可能会发生经酶介导的代谢（如酯键和酰胺键的水解），影响ADC的PK进而影响ADC的药效和安全性（图2b）。
图2. ADC药物的主要生物转化通路
ADC稳定性评价的主要方法包括测定ADC的游离药物释放率和DAR值变化。仅检测释放的游离药物浓度变化不足以全面体现ADC的稳定性，原因是：1、释放药物的形式可能是本身也可能是其降解产物，2、在酶的作用下，连接子断裂的位置不同导致释放出来药物上带的片段不同；由于释放产物在样品中存在丰度差异，全面收集这些信息极具挑战。如图3的案例所示，由于存在不同形式的有效载荷，稳定性样品游离药物浓度随孵育时间的增量无法对应DAR值的降低量，不足以评价ADC的血浆稳定性。DAR值变化对于ADC稳定性评价更加重要。ADC生物样品中DAR采用免疫捕获后用高分辨质谱分析的方法检测，释放的游离药物及其降解产物浓度可以采用LC-MS/MS方法测定。
图3. Tras-mcVC-Auristatin的血浆稳定性评价
血浆孵育144 h后，Tras-mcVC-Auristatin的DAR值和游离药物浓度变化（上）；
不同形式有效载荷的定量分析（下）
DAR是评价ADC体外血浆稳定性的重要指标，DAR的变化能直观体现抗体上面有效载荷的负载水平（见图4）；在体内药代动力学研究中，DAR的变化跟体内药效具有较强的相关性。DAR值过低会降低药物的抗肿瘤效应，而DAR值过高可能会影响抗体结构、稳定性，进而降低药物活性。与裸抗或DAR值低的ADC药物相比，DAR值高的ADC药物容易聚集，清除率较高。有研究分别给予SCID小鼠裸抗，DAR2，DAR4和DAR8的ADC药物研究其PK行为差异，结果表明，相同剂量下，DAR8 ADC的PK药物暴露量（AUC）低于DAR2 ADC，高DAR的ADC表现出更高的清除率；而3个ADC的药时曲线的分布相也有差异，分布容积随DAR值增加而增大。
值得一提的是，在相同抗体剂量下，尽管DAR4 ADC只含半数于DAR8 ADC的payload，DAR4 ADC在小鼠异种移植模型的抗肿瘤效应和DAR8 ADC相当；DAR2 ADC则是需要更高的剂量；此外，DAR2 ADC的最大耐受剂量（MTD）至少是DAR4 ADC的两倍，后者的MTD约等于DAR8 ADC的两倍。以上结果显示，在选择候选药物的DAR时，需要结合不同DAR的PK，综合考量不同DAR对药物疗效和安全性的影响，选择最佳治疗窗的候选药物。
有研究显示，DAR值越高，ADC药物在人血浆中形成聚集体的速度越快（见图5）；并随着DAR值的增加，IgG的CH2稳定性降低，容易导致聚集体的形成，而这一现象在血浆基质更明显。DAR值相关的ADC聚集可能会影响ADC在组织器官的分布和ADC的清除机制，如聚集体的生成会增加肝细胞对ADC的摄取，通过降低ADC的疏水性能够减少Kupffer细胞和肝窦内皮细胞的摄取，从而可能将肝组织和/或其他组织器官暴露于高浓度活性药物。当DAR值较高时，与疏水性的有效载荷相比，亲水性的有效载荷对ADC体内处置的影响更小。
图4. 不同DAR值ADC示意图
图5. Ab095-vc-MMAE在人体血浆的聚集体生成率
因此，从药物早期筛选阶段到PCC选择到IND申报甚至临床阶段，准确测定生物样品中ADC药物DAR值，将有助于更好地理解ADC分子的安全性和有效性，并协助研究者研发出具有更高安全性和更好有效性的ADC。
目前常用的DAR值测定方法有紫外-可见分光光度法、疏水相互作用色谱法等，大部分方法仅适用于分析成分简单的纯溶液样品，如紫外-可见分光光度法会受到溶液中过量的小分子影响，而疏水相互作用色谱法局限于半胱氨酸偶联的ADC。而血浆等生物样品中DAR的测定面临更多挑战，比如血浆中大量IgG或者其他内源蛋白的干扰，复杂的样品前处理和数据分析等。ICE成功建立了LBA-LC-MS方法，用于检测血浆中ADC的DAR值。采用上述方法对DS-8201（曲妥珠单抗-德鲁替康偶联物）进行血浆稳定性的研究。结果显示，DS-8201在小鼠血浆37℃孵育0、3、7天后DAR值分别为7.9、6.8、3.6；该方法可用于评价偶联到半胱氨酸上的ADC体外和体内血浆中DAR的分析，包括传统的偶联ADC和位点特异性偶联ADC。
在药物开发过程中，准确测定生物样品中ADC药物的DAR值对于理解其安全性和有效性至关重要。通过免疫捕获和高分辨质谱分析等方法，可以全面评估ADC的血浆稳定性和药效。选择合适的DAR值不仅影响药物的抗肿瘤效应，还涉及药物的聚集、清除率和组织分布。因此，从药物早期筛选到临床阶段，持续监测和优化DAR值将有助于开发出更安全、更有效的ADC药物。
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参考文献
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2025-08-31
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