•意义:NP药物发现在识别和验证靶点方面面临挑战。利用化学蛋白质组学的标记和非标记技术的最新进展改进了靶点识别，促进了药物开发。

•影响:将这些方法与用于靶点识别的新技术相结合，将增强对NPs分子机制的理解，并加速药物开发过程。

•创新:它们提供了NP靶点的全面视角，增强了理解并促进了药物开发

摘要

利用化学蛋白质组学进行靶点鉴定，是天然产物药物开发的一个不断挑战的努力。了解它们的靶点对于破译它们的机制和开发潜在的探针或药物至关重要。识别分为两大类:标记技术和无标记技术。标记法使用标记有生物素或荧光标记的分子，以方便检测与目标蛋白的相互作用。在标记之前，为了避免生物活性或结合特异性的变化，结构-活性关系是必不可少的。相比之下，无标记技术在不修饰天然产物的情况下识别目标蛋白，依赖于这些产物存在或不存在时的稳定性、热性质或沉淀的变化。每种方法都有其优缺点，有助于全面了解纳米粒子的作用机制和治疗潜力。本文总结了天然分子的靶点识别技术，重点介绍了一些值得关注的天然产物NPs的案例研究，并展望了未来的应用和方向。

1.介绍

在过去的40年里，天然产物(NPs)已经成为新药最重要的起点和先导化合物之一。与化学合成化合物相比，NPs具有广泛的生物活性、生物相容性、化学新颖性、多样性和富有想象力的化学空间纳米粒子通常包含作为首选配体进化的分子结构和模式-蛋白结合基序与酶的相互作用及其生物合成过程。因此，受np启发的药物发现在设计合成的含有np片段/基序的化合物或简化模拟自然界化学的np方面取得了巨大成功。据报道，自1939年以来，超过50%的美国食品药品监督管理局(FDA)标记药物直接或间接来源于自然来源，对癌症、炎症和传染病特别有效。然而，开发基于np的新型药物的过程漫长且昂贵，这可能是因为在彻底理解作用机制方面存在挑战，特别是在np类化合物的结合靶点方面。确定纳米粒子的结合靶点是发现和开发新的天然药物的关键初始步骤，从而确定作用机制，临床观察药物代谢和/或副作用。此外，纳米粒子也被用作化学生物学探针的来源，用于研究特定蛋白质的生物学功能。然而，在实际的研究过程中，经常发现多个蛋白靶点而不是单一蛋白与所研究的纳米粒子相互作用。这些多靶点现象使得对纳米粒子真正靶点的阐明非常全面且充满挑战。因此，迫切需要使用特定的方法进行靶点识别，以全面识别nps的靶点近年来，NP靶点的鉴定在药物发现中变得越来越重要（图1）。通常，具有明确蛋白靶点的NPs在被开发成临床药物之前都需要进行结构修饰。阐明结构-活性关系(SAR)和阐明作用机制是两个主要目的。随着目标的阐明，应用人工智能(AI)和化学生物学的基于目标的优化和基于配体的优化，如结构简化和基于片段的设计，成功地应用于开发治疗各种人类疾病的衍生物。、

化学蛋白质组学、化学基因组学、多组学技术、基于单细胞的技术、生物信息学和全转录组标签分析等多种鉴定方法各有利弊。在这些方法中，化学蛋白质组学，结合合成，细胞生物学和质谱，使用标记或非标记的NPs可以直接分析小分子的靶蛋白它已成为捕获和鉴定nps胞内蛋白靶点的有效方法。本综述以靶点发现实例为基础，总结了基于化学蛋白质组学发展的靶点鉴定方法，包括标记和非标记NPs，并对其原理、实验步骤、优缺点和适用范围进行了全面讨论。此外，我们还将对有代表性的纳米粒子进行个案研究，并讨论该领域的未来应用和方向。

2. NPS的标记靶标鉴定

标记NP方法可作为识别靶点的主要方法。由此产生的NP衍生分子探针主要由报告体(如生物素、双正交反应、光标记、降解相关基团)、连接体和活性NP部分组成。以化合物为中心的化学蛋白质组学(CCCP)和基于活性的蛋白质谱分析(ABPP)是研究小分子药物靶点最常用的方法。其工作机制依赖于小分子的活性基团段与预期靶点紧密结合，而报告基团段有效地标记生物靶点。随后，利用亲和纯化技术富集已被探针选择性结合的蛋白。接下来，可以通过各种技术进行靶点的验证，包括凝胶电泳和基于质谱的蛋白质组学(图2)。在这里，我们将介绍包括CCCPs、生物素标记探针、双正交策略、光亲和探针和基于降解的蛋白质谱(DBPPs)在内的标记方法，以及一些在NPs中的代表性应用。

2.1. CCCP 

CCCP是一种识别目标蛋白的开创性方法，它用标记分子修饰NPs，然后固定在基质上，如琼脂糖珠或其他树脂。这样就可以富集可与NPs结合的蛋白质，然后通过质谱进行鉴定(图2A)。该方法具有快速、高通量富集目的蛋白的优点。1989年初，Schreiber研究小组制备了天然免疫抑制剂FK506的亲和基质(图3)，并利用亲和层析法筛选结合蛋白，即FK506结合蛋白12 (FKBP12) 。研发1型糖尿病治疗方案的Kubicek研究团队将青蒿素与稳固的支撑剂联系起来，并在存在和不存在竞争性游离蒿甲醚的情况下进行了下拉实验。他们通过质谱鉴定gephyrin是aTC1细胞中富集最显著的特异性相互作用蛋白。他们的研究结果表明，gephyrin是青蒿素依赖于GABAA受体信号传导增强的哺乳动物靶点。将哈德威基酸(HAA)通过Tosco固定在基质载体上，然后在U937细胞裂解物中孵育化学蛋白质组学显示HAA可与热休克蛋白27 (Hsp27)结合。Zhang团队研究了天然倍半萜内酯IJ-5的抗炎特性和靶蛋白。通过与环氧活化的Sepharose 6b磁珠反应，对IJ-5进行靶蛋白鉴定。通过利用IJ-5中的活性羟基，他们创造了一个共价键，将IJ-5分子固定在固体载体的表面。泛素连接酶UbcH5通过形成NPs进一步被发现是其靶蛋白。该化合物通过机制阻止泛素分子与UbcH5的结合，从而抑制NF-kB炎症信号通路的激活，发挥抗炎作用。Zeng等确定了促进线粒体融合过程的天然松果菊苷(ECH)的结合靶点。他们制备了ECH共轭环氧活化的琼脂糖珠(ECH珠)，质谱(MS/MS)分析明显的银染色带确定了CK2α'为结合靶点。然而，这种方法需要改变NPs的结构，因此可能不适用于具有复杂结构或缺乏足够化学修饰位点的生物活性NPs。

2.2. ABPPs

ABPP策略于2002年由Cravatt小组首次提出，并被广泛用于nps的靶点识别。该方法来源于CCCP，具有更方便、适用范围更广的特点。与CCCP不同，ABPP的核心在于利用基于活性的探针(activity-based probes, ABPs)靶向功能相关的蛋白基团，使不同酶的活性位点共价修饰。因此，ABPP技术的关键步骤是有源探针的设计和合成。这些探针包含两个基本成分:结合或修饰靶蛋白活性位点的反应部分和用于检测和分离蛋白的化学标签。然而，探针合成过程中引入的标记物可能会影响目标NPs的活性。我们应用点击化学和光亲和标记技术来扩大ABPP的适用性(图2)。此外，连接子的设计通常包含特定的官能团，以防止ABPs与其预期的蛋白质靶点之间的空间位阻。目前，abp被大致分为3个不同的组: (a)亲电探针，如α、β-不饱和结构，选择性地修饰靶蛋白活性位点中的亲核残基(图2B); (b)使用可点击标签进行的双正交化学反应，旨在直接在感兴趣的位点引入不同的受体标签(图2C);能够通过光激发激活与蛋白质形成共价键。

2.2.1. 生物素标记探针。生物素与链霉亲和素和中性亲和素特异性结合，代表已知最强的蛋白-配体相互作用之一(图2B)。因此，生物素修饰被广泛用于富集、纯化和鉴定活性NPs的细胞内靶点。该方法的优点是在亲和纯化之前，生物素修饰的NPs可以完全与细胞蛋白质组相互作用，甚至可以与细胞膜内的靶蛋白相互作用。2001年初，Crews研究小组开发了一种生物素-小白菊内酯(图4)，并证实其与IkappaB激酶β (IKKβ)的半胱氨酸179共价结合，从而发挥抗炎作用。2012年，Chen小组发现一种天然二萜类化合物腺嘌呤(adenanthin)可以诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化在SAR研究的基础上，我们开发了一种生物素标记的腺嘌呤，以阐明Peroxiredoxins (Prx I和Prx II)的半胱氨酸作为直接靶点。2015年，Lei团队对天然存在的抗炎分子ainsliadimer a 的结构组成进行了生物素修饰。他们使用探针鉴定了IKKα/β作为其抗炎作用的靶点蛋白，并证实了IKKα/β能够选择性地与IKKα/β的半胱氨酸46形成共价键。据报道，一种强效的天然细胞毒素ipomoeasin F对许多肿瘤细胞系的生长有抑制作用，抑制率在个位数纳摩尔范围内。2019年，Shi团队开发了Ipomoeassin F的生物素探针，并通过化学蛋白质组学鉴定了Sec61亚单位α亚型1 (Sec61α)作为活细胞中的直接结合伴侣。Zeng group发现天然衍生的野马追内酯B (EB)具有抑制BV-2小胶质细胞神经炎症的作用生物素标记的EB用于检测HuProt蛋白芯片，USP7被鉴定为EB的潜在靶点。进一步的共晶体学证实，位于独特的非催化HUBL结构域的Cys576被选择性修饰并随后引起Keap1泛素化依赖性降解。最近，Tang研究小组发现，抗疟NPs青蒿素类药物可在啮齿类动物模型和人类患者中改善难治性多囊卵巢综合征(PCOS) 38合成具有活性的生物素标记的青蒿琥酯(bio-ATS)，用于捕获离子肽酶1 (LONP1)的pull-down实验。其他检测支持青蒿素直接靶向LONP1并增强LONP1- cyp11a1相互作用。这项显著的研究不仅为青蒿素在PCOS治疗中的应用开辟了新的途径，而且确定了LONP1-CYP11A1相互作用作为PCOS发生的潜在治疗靶点。然而，该富集过程主要依赖于生物素和链霉亲和素之间的不可逆结合，这对ABPP工作流程的复杂性提出了重大挑战，并限制了质谱检测到的蛋白质数量。为了解决这些局限性，我们不断地进行优化和改进。例如，Hacker团队引入了一种去硫生物素(DTB，图4)标签，该标签便于洗脱，从而消除对内源性生物素化的干扰，并最大限度地减少肽的损失。通过合成含有DTB标签的探针分子，并将其与金黄色葡萄球菌的蛋白质组孵育，结果表明，DTB标记的探针提高了处理效率，同时增强了金黄色葡萄球菌蛋白质组中的半胱氨酸覆盖。另一方面，相对较大的生物素体积往往会影响小分子化合物的原有活性，导致活性降低或丧失该方法在医学研究中具有一定的挑战性和局限性，为利用该方法进行靶蛋白的鉴定提供了新的策略或改进。

2.2.2.  Bioorthogonal策略。随着生物正交性概念的出现及其反应类型的不断扩展，生物正交反应被引入到探针分子的设计中。相对较大的生物素标签已被结构简单的生物正交基团(如叠氮或炔)所取代，这些基团随后可通过Cu(I)催化的叠氮-炔环加成(CuAAC)反应连接到报告基团。在实验过程中，活性探针靶向并标记蛋白质组，然后通过其末端把手(如叠氮化物/炔烃、strain烯烃/四氮、四氮/环丙烷)与报告基团共价交联，实现可视化、富集(如生物素、荧光标记)和其他目的(图2C)。这种设计可以最大限度地减少探针的空间阻碍，优化其对目标蛋白的标记效率，简化合成步骤，降低整个实验的复杂性。近年来，在NP中引入生物正交反应基团已成为应用最广泛的靶点识别策略之一，许多NP靶点已通过合成相应的探针被阐明。Salinipostin A (Sal A，图5)是一种具有抗疟原虫活性的海洋天然产物，被开发为Sal A衍生的ABP (Sal alkyne)，用于识别其在恶性疟原虫(Plasmodium falciparum, Pf)寄生虫中的靶点。用Sal A或对照预处理Pf寄生虫培养物，并用Sal炔烃标记培养物进行竞争。生物素叠氮点击化学和串联质谱分析发现，与人单酰基甘油脂肪酶(MAGL)序列相同的溶血磷脂酶(Pf PARE)、出口脂肪酶2 (Pf XL2)和类bem46蛋白(PBLP)是Sal A在Pf中的主要靶点。Chen团队基于SAR研究，开发了天然产物活性探针BE-43547A2，用于原位点击化学的目标捕获工作他们发现抗肿瘤作用是通过共价修饰真核翻译延伸因子1a1 (eEF1A1)的半胱氨酸234 (C234)残基来发挥的。青蒿素及其衍生物的确切抗疟机制仍不清楚。Lin组使用炔标记的青蒿素探针AP1进行了无偏倚的化学蛋白质组学研究，并鉴定了124个共价结合蛋白靶点我们发现，与AP1相互作用的5种酶(鸟氨酸转氨酶(OAT)、丙酮酸激酶(PyrK)、l -乳酸脱氢酶(LDH)、亚精胺合酶(SpdSyn)和s -腺苷蛋氨酸合成酶(SAMS))被添加过量青蒿琥酯完全阻断，并且观察到剂量和时间依赖性AP1 - OAT结合。然而，这种结合需要加入血晶素，而血晶素还原剂如维生素C、Na2S2O4或谷胱甘肽可以改善这种结合。进一步的验证试验表明，青蒿素的激活主要依赖于血红素。据报道，杀铁剂(Ferroptocide)是一种来源于截骨侧耳素的二萜天然产物，可诱导癌细胞发生铁死亡47合成并筛选用于HCT 116细胞靶向鉴定的化学探针P29。LC - MS/MS分析提供了300多个靶点，CRISPR敲除研究提示硫氧还蛋白是杀铁剂的结合靶点。穿心莲内酯(Andrographolide, Andro)是穿心莲的天然产物，具有抑制多种肿瘤细胞增殖的活性。我们开发了一种可点击的ABP，命名为P2，并保留了活性。原位蛋白质组分析和靶点验证证实Andro在Cys62位点与NF-κB p50特异性结合。具有抗炎和细胞保护作用的亚硝基脂肪酸能够与未确定的蛋白质形成共价加合物。Zhang团队应用生物正交策略开发了一种可点击的硝基脂肪酸探针，用于检测哺乳动物蛋白的硝基烷基化。在THP1巨噬细胞中，通过探针鉴定糖皮质激素受体(NR3C1)进行共价修饰。Tate组研制了新的胆固醇化炔基探针，生物正交试验发现sonic hedgehog蛋白(Shh)可能是胰腺导管腺癌细胞的结合靶点。Kim小组研究了从Tussilago farfara中分离的倍半萜类化合物在人乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF-7)中的作用利用叠氮化物探针8对200多种潜在蛋白进行鉴定，发现14−3−3蛋白zeta(基因名称:ywhaz)的Cys25和Cys94以及过氧化物还原蛋白1 (PRDX1)的Cys83具有较高的概率。然而，这类NPs的确切作用机制仍未完全阐明。

2.2.3. 光亲和探针。与具有共价结合部分的NPs不同，大多数活性NPs是非共价结合靶蛋白的。相互作用通常是不稳定的，很难研究，尤其是富集步骤。因此，简单的点击化学探针不适合用于目标识别，而且很容易被干扰。光亲和力标记策略(图2D)是光激发使光活性基团与目标蛋白共价交联，从而提高目标识别的灵敏度、效率和空间精度的解决方案。光亲和探针通常包含位于原始NP的适宜位置用于结合和富集的可点击手柄以及用于固定结合的光活性片段。光激发可以在原位进行或使用细胞裂解物。二苯甲酮、芳基叠氮化物和二氮嗪是应用最广泛的光标记片段。Asimicin(图6)是从Asimina trilobal Dunal分离出的NP，是NADH:泛醌氧化还原酶(复合体I)的强效抑制剂54asimicin的活性光亲和性探针命名为[3H]二苯甲酮-asimicin ([3H]BPA)，与NADH脱氢酶2 (ND2)、ND1和ND5亚基光交联。Sieber团队开发了三种活性万古霉素探针:探针1在游离c端含有二苯甲酮酰胺，在糖上含有炔，探针2对侧修饰，探针3在万古胺糖上含有两种官能团。3种探针对金黄色葡萄球菌、MRSA和VSE均有较强的抗菌活性，且具有相同的靶蛋白偏好。通过罗丹明-生物素叠氮标签和质谱分析，我们发现双功能的自溶素(ATL)和肽ABC转运蛋白(pABC)可能是万古霉素在活细胞中两个重要的膜靶点。查尔酮是多种天然来源的一系列α、β-不饱和酮类化合物。然而，许多研究未能很好地确定查尔酮的结合靶点。Xing团队开发了查尔酮化合物库，并设计了结构相似的探针，具有明显的细胞毒性进一步设计获得三个三功能探针(C95, C90, C91)，其具有用于UV照射的叠氮化物和用于基于点击化学的富集的炔。化学蛋白质组学发现一个52 kDa的蛋白β-微管蛋白作为特异性结合靶点，并对N337−K350 (NSSYFVEWIPNNVK)肽段进行修饰。这项研究被另一组的查尔酮衍生物与微管蛋白的首次共晶体学证实。Cecioni组开发了一种氟化叠氮-香豆素聚焦剂(探针12)，具有快速和温和的光标记作用该支架可以成功地对糖-蛋白相互作用进行荧光标记。这种名为氟交联剂的新策略可能对捕获非共价结合的NPs非常有用。

近年来，基于二氮嗪的光亲和探针因其体积小、反应效率高而备受关注。胆固醇是细胞膜的重要结构成分，具有未知的固醇结合蛋白。Cravatt研究小组设计了光亲和探针，以便在活的哺乳动物细胞中全面定位结合蛋白。在C6位的光激活二氮嗪基团和加入到烷基侧链中的炔得到了这些探针，不同的是，非对映体OH被命名为顺式甾醇、反式甾醇和表式甾醇。在活细胞中，探针与紫外光孵育，与蛋白质靶标共价反应。随后点击化学、富集和定量蛋白质组学鉴定出250多种胆固醇结合蛋白，尤其是调节糖、甘油脂和胆固醇的酶类。胆汁酸是胆固醇的一种内源性代谢物，具有调节脂质、糖代谢和肠道菌群组成的作用。然而，在蛋白质组中与ba相互作用的蛋白却知之甚少。Lei团队开发了结构多样、可点击的基于ba的光反应探针，在不同位置上具有二氮嗪和炔化学蛋白质组学策略和定量质谱在全球范围内分析哺乳动物细胞中ba相互作用蛋白。共发现600多种蛋白质，其中6种蛋白质经Western blotting进一步验证，首次发现3种蛋白质(CPT1A、ADPGK和COMT)。然而，二氮嗪-电压依赖性阴离子通道也被发现对神经类固醇和胆固醇具有非特异性结合作用。Lin研究团队开发了2-芳基-5-羧四唑(ACT)作为一种新的光亲和标记物，并使用达沙替尼验证了其原位靶点识别的效率，还有报道称JQ-1.67 4-叠氮酰亚胺(AzPI)可在紫外线照射下与蛋白质共价荧光结合。然而，它们在纳米粒子中的光交联反应性还有待进一步研究。

2.3. DBPPs。基于降解的蛋白谱分析(DBPP)是一种将蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)技术与定量蛋白质组学和质谱技术相结合的新策略，可识别np的多个靶点(图2E)。理论上，与非protac的纳米粒子探针相比，目标蛋白将被下调/降解。与ABPPs不同，DBPP是依赖蛋白质-蛋白质相互作用(PPI，靶蛋白-降解物- e3连接酶三元复合物)的策略，而不是小分子-蛋白质相互作用。因此，DBPP的一个显著优势在于它对靶点和小分子之间亲和力的要求不那么严格。这种灵活性对于通常表现出中等活性的纳米粒子是有利的。Rao团队使用天然雷公藤红素进行了一项概念验证研究，该团队开发了基于CRBN的PROTAC ZH011，其PEG连接子具有高抗增殖活性(图7)。定量蛋白质组学和MS鉴定并确认了多个潜在靶点，包括IKKβ、PI3Kα、CHK1、OGA、CIP2A、ERCC6L、NR4A1、DCAF16和NEK7。与此类似，Chen团队利用CRBN配体设计了一个lathyrol的PROTAC分子(ZCY-PROTAC)，阐明了5/11/3元NP lathyrol的特异性靶点定量蛋白质组学结果显示，MAF BZIP转录因子F (MAFF)蛋白在RAW264.7和HEK293T细胞中表达显著下调。鉴于其特殊的可行性和可靠性，基于protac的方法将成为识别NP靶点的宝贵研究工具。

3. NPS的无标记靶标识别

上述传统的基于abp的目标识别策略已被证实是切实可行的。然而，这些技术需要对特定位置的相关标签进行修改。从逻辑上讲，对NPs进行广泛的SAR研究对于引入标签以保持其原有的生物活性是必不可少的。另一方面，在细胞内低丰度或弱结合的蛋白质鉴定是非常困难的。为了克服这一瓶颈，研究人员开发了一系列新颖的、无标记的目标识别技术。这些技术可分为基于蛋白水解的、基于热的、基于蛋白质沉淀的、目标响应性可及性分析(TRAP)和多重硫醇反应性分析(MTRP)(图8)。

3.1.  蛋白水解技术。蛋白水解技术的原理是，小分子与靶蛋白的结合可以改变其结构，从而改变其对蛋白水解降解的敏感性。这类技术包括药物亲和力反应靶点稳定性(DARTS)、有限蛋白水解质谱(LiP-MS)、脉冲蛋白水解(PP)和来自氧化速率的蛋白质稳定性(SPROX)。DARTS的原理是在与小分子药物结合后稳定目标蛋白结构，从而降低其对蛋白酶蛋白水解降解的敏感性。这种方法不需要对小分子化合物进行化学修饰，因此可以在不受化学限制的情况下识别任何小分子的结合靶点。在DARTS实验中，为了评估酶降解蛋白质的效果，通常采用特定的方法，包括银染色或考马斯亮蓝染色，以及双向凝胶电泳(2D-PAGE)、基于凝胶或无凝胶的质谱等技术。

通常通过对照比较、凝胶内酶切和质谱鉴定等方法鉴定NPs的候选靶蛋白条带。作为一项概念验证研究，Huang团队证实，在雷帕霉素存在的情况下(图9)，经过充分研究的靶点FKBP12的蛋白水解明显减少。应用dart技术，发现桦木酸在乳腺癌细胞中的作用靶点为葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) 。Zeng组应用pull-down和DARTS确定V-ATPase中的ATP6 V0D1亚基是五味子醇A对晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导的神经保护作用的靶点。dart鉴定出海洋代谢物5-epi- sinuletolide可靶向肌动蛋白，从而破坏肌动蛋白细胞骨架。以DARTS为盐霉素的结合靶点，研究核仁素对神经母细胞瘤干细胞的抑制作用。

有限蛋白水解偶联质谱(LiP-MS)是一种新的蛋白质组学方法，可直接在全蛋白质组水平上鉴定蛋白质结构变化。Liu研究小组利用LiP-MS发现金丝桃素可以直接靶向二氢硫辛酰胺s -乙酰转移酶(Dlat)促进脂肪细胞产热DARTS和LiP-MS均可提供具有生物活性的纳米颗粒的潜在靶蛋白，但在识别低结合或低丰度的蛋白方面仍然有限。PP, 利用折叠蛋白和未折叠蛋白对蛋白水解酶敏感性的差异来定量评估蛋白稳定性这种方法通过追踪配体结合后蛋白稳定性的变化来确定配体对其蛋白靶的亲和力。PP系专门消化包含折叠蛋白与未折叠蛋白之平衡混合物中的未折叠蛋白;然而，低的蛋白质组覆盖率和敏感性限制了其广泛应用。SPROX是另一种基于检测配体诱导的蛋白稳定的方法。与DARTS不同，SPROX测量的是目标蛋白中蛋氨酸残基的氧化水平，而不是蛋白水解模式81蛋白质经过氧化氢处理后甲硫氨酸残基的氧化水平可作为蛋白质变性的指标。可通过与NP结合改变变性体，实现无标记蛋白质组筛选。Manassantin A是一种天然抗癌化合物，通过结合SPROX和PP方法成功发现其靶向延伸因子1 α。

3.2. 热稳定性技术。加热会使目标蛋白发生未折叠和变性，与NPs结合会改变蛋白的热稳定性。基于热稳定性的技术可以在细胞或组织中检测NPs与目标蛋白的结合，例如细胞热位移分析(CETSA)及其衍生的热蛋白质组分析(TPP)。CETSA最早由Molina等于2013年建立，用于监测活细胞和细胞裂解物中分子的目标蛋白结合。细胞或裂解物经过载体或药物的处理，然后经受一系列不同的温度。推导潜在靶点蛋白的热变性谱，量化其熔解温度的变化，验证药物与各自已知靶点的结合。但CETSA对Western blot检测和现有抗体的要求限制了其应用，且存在通量低、灵敏度低的缺点。因此，它被广泛应用于NPs的靶点验证。TPP应用了带有同位素标记的多重qMS，并在蛋白质组学水平评估了配体与靶标的结合，从而克服了cetsa的局限性。Cristobal研究小组利用TPP确定了海洋NP 132-羟基脱镁叶绿素(图10)在HepG2细胞中的减脂活性的结合靶标。目前发现3个蛋白质靶点，包括异柠檬酸脱氢酶(IDH)、乙醛脱氢酶(ALDH)和磷酸丝氨酸转氨酶(PPSA)，调节胰岛素敏感性和能量代谢。Sieber组将紫囊杆菌NP vioprolia在Jurkat细胞中的特异性结合靶点定为核蛋白14 (NOP14) 。Tutin是诱导急性癫痫发作的毒理学NP，通过TPP方法确定其靶向钙调神经磷酸酶。TPP证实ACT001是来源于忍香内酯的临床抗胶质母细胞瘤化合物，可直接结合纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PAI-1)，从而抑制PI3K/AKT通路。TPP也被扩展到组织领域，评估NP在多个器官和血液中的参与。基于CETSA，我们开发了基于热稳定性位移的荧光差异二维凝胶电泳(TS-FITGE) ，然而，在NP靶点的应用报道仍然较少。

3.3. 蛋白质沉淀技术。对于热稳定性变化不明显的目标蛋白，与NP结合的目标蛋白对变性和有机溶剂、压力或其他因素的沉淀不太敏感。化学变性和蛋白质沉淀(CPP)是第一个开发的方法。CPP是SPROX和TPP的交叉组合，用于分离折叠和未折叠的蛋白质，但克服了SPROX对蛋氨酸的依赖。菲茨杰拉德小组开发了这种方法，并利用它鉴定了酵母中NPs环孢素A和格尔德霉素的已知靶蛋白(图11)。他们还鉴定出PRMT1和PRMT6是人MCF-7细胞中sinefungin的最高潜在结合靶点。与SPROX相比，该方法显著提高了蛋白质组学覆盖率和假阳性率。本研究还进一步改进了几种类似的方法，如蛋白质差异沉淀(DiffPOP)和溶剂诱导蛋白质沉淀(SIP)。在NP靶点识别中的应用还需要更多的实践。

3.4.   TRAP和MTRP。2023年，Hao团队引入了目标响应性可及性谱分析(target-responsive accessibility profiling, TRAP)方法，该方法在全球范围内标记细胞内np结合蛋白的反应性蛋白赖氨酸。TRAP方法采用一种直接且快速的还原二甲基化反应，并识别出在配体孵育前后表现出显著丰度变化的含活性赖氨酸的肽。Sun研究小组发现，雷公藤红素(图12)可改善高脂饮食诱导的代谢综合征，并利用TRAP技术将结合靶点确定为腺苷酸环化酶相关蛋白1 (CAP1) 。同样，该研究小组发现环黄芪醇可靶向组织蛋白酶B，从而增强CD8 T细胞的抗肿瘤免疫。Hao组使用TRAP确定水飞蓟宾(一种肝保护NP)在HepG2细胞中的结合靶点为酰基辅酶a合成酶长链家族成员4 (ACSL4)，从而抑制铁死亡。这种方法具有高覆盖率和高通量;然而，这需要在细胞裂解之前标记蛋白质组内的赖氨酸残基，这在裂解过程中有破坏配体-靶点相互作用的风险，这可能导致配体靶点的错误识别。Yang团队开发了一种新的化学蛋白质组学策略，命名为多重巯基反应谱(multiplex thiol reactivity profiling, MTRP)，用于亲水性nps的靶点鉴定收集无标记的亲电NPs处理的细胞蛋白质组，裂解，用炔化碘乙酰胺探针(IPM)标记，并用胰蛋白酶消化。然后，我们进行了类似于ABPP分析的程序，亲电np竞争性地抑制了IPM的一簇半胱氨酸。利用该方法，首先鉴定了天然藤黄酸共价修饰XPO2的C842和C939残基，而乙酰布里坦尼内酯共价抑制了XPO2的C442残基的HSP60分子伴侣活性。因此，MTRP方法能够以特定位点的多路复用方式有效地识别NPs的目标，并易于在学术和工业领域使用。

4. 结论和观点

NPs是药物发现的极其重要的来源。然而，由于难以阐明结合靶点和作用机制，NPs尚未得到充分利用。揭示蛋白质和NPs之间的相互作用对于理解它们的作用模式和治疗效果至关重要。标记和非标记技术已被广泛应用于纳米粒子靶蛋白的发现和验证。根据具体的研究问题和实验限制，每种方法都有其独特的优势，它们共同提供了对NPs作用机制和潜在治疗应用的全面理解。后续的功能分析应进一步探索，以验证已鉴定的靶点的生物学相关性，并揭示这些靶点蛋白在生物系统中的新作用。

尽管如此，以下仍列出了许多挑战。首先，标记方法绝对有用。然而，我们需要对NPs进行广泛的SAR研究，以明确修饰的合适地点。由于获得NPs，包括合成可行性、隔离性、可修改性等，这始终是一个挑战。其次，不同的修饰，例如不同的官能团、荧光标记或探针类型，可能会导致不同的结果。可靠的阴性对照设计对于减少假阳性的可能性变得尤为重要。设计了生物正交探针并将其应用于活细胞，使其能够更全面地获取目标蛋白。第三，各种化学蛋白质组学方法有其独特的优势和局限性。采用2个或2个以上的蛋白质靶点发现策略可以提高蛋白质组覆盖率，减少假阳性，提高成功率。第四，无标记方法是可行的，可以避免SAR研究和探针合成的挑战。为进一步提高无标签方法的靶点识别结果的可靠性，应注重实验设计和数据处理。阴性和阳性对照组的设置对于从非特异性背景信号中区分特异性交互作用至关重要。热蛋白质组分析(TPP)和数据独立采集(DIA)等定量方法的采用可显著提高热位移定量的精度和灵敏度强烈建议使用无标签方法与有标签方法相结合。例如，Fitzgerald团队引入了一套策略，包括SPROX、PP、CPP和TPP，以显著提高蛋白质组覆盖率并降低假阳性率104基于化学蛋白质组学的靶标鉴定面临的挑战包括检测低丰度的蛋白质、相对较长的操作过程以及质谱固有的随机性，这些都需要在仪器和样品上进行改进。为了减轻这些挑战，必须将富集策略与最先进的质谱技术相结合，以提高检测灵敏度。此外，计算机模拟预测和基于网络的分析等计算方法的集成有助于在实验验证前对潜在目标进行优先排序，从而提高成功识别的可能性。同时，通过设计共价探针和建立多组进行交集分析，可以提高蛋白质组的覆盖率。

靶点识别仍然是np类药物开发中最关键和最耗时的步骤。需要新技术。计算预测以及生物信息学和网络分析是未来的发展方向，它们提供了大量的信息，缩短了时间，有时还作为补充信息例如，将高通量测序与基于crispr - cas9的基因组编辑相结合的DrugTargetSeqR等方法在阐明药物机制以及识别与耐药性相关的遗传和表观遗传机制方面显示出了巨大潜力。将这些计算方法与传统实验技术相结合，可以提高目标识别的效率和准确性。此外，由Lamb等首先提出的Connectivity Map展示了基因表达标签如何与小分子、基因和疾病进行系统连接。单细胞多组学技术为疾病过程中不同水平的NPs机制提供了见解。DBPPs可诱导靶蛋白的降解或调节，是PROTAC领域靶点鉴定的一个新方向和延伸。与DBPPs类似，分子胶水也可用于靶点识别。例如，nimbolide可诱导癌细胞中RNF114 E3自泛素化和p21泛素化。我们发现贝司他丁甲酯(ME-BS)可以直接作用于cIAP1的BIR3结构域，从而降解cIAP1 E3。结合标记和非标记方法以及系统整合其他用于NPs靶点鉴定的新技术，将加速NPs在生物系统中的分子机制理解。所有这些技术都需要后续的验证，如靶向结合的生物物理检测、特定蛋白敲除/敲除和功能实验。在未来，预期的技术进步旨在通过利用智能去卷积方法简化这一过程，从而更有效地从整个蛋白质组中缩小潜在靶点。

Wang S, Zhang Y, Yu R, Chai Y, Liu R, Yu J, Qu Z, Zhang W, Zhuang C. Labeled and Label-Free Target Identifications of Natural Products. J Med Chem. 2024 Oct 3. doi: 10.1021/acs.jmedchem.4c01576.