2025年5月10日，Nature communications发表了题为“Let-7 restrains an epigenetic circuit in AT2 cells to prevent fibrogenic intermediates in pulmonary fibrosis”的研究论文。研究揭示了let-7 miRNA家族维持肺泡稳态的关键分子机制及其在肺纤维化中的保护作用。通过构建AT2细胞特异性let-7afd敲除小鼠模型，发现let-7通过抑制BACH1/EZH2/MYC基因网络，阻遏肺泡上皮细胞向促纤维化中间态的异常转化。研究证实let-7缺失导致KRT8 transitional cell异常累积，并通过激活PI3K/AKT/mTOR通路和EMT进程驱动纤维化。该工作不仅阐明肺泡再生受阻的表观遗传调控机制，通过IPF单细胞测序数据验证了该通路的临床相关性，为开发靶向miRNA的表观遗传疗法提供了理论依据。建立了miRNA-表观遗传网络-细胞可塑性的多维调控模型，对理解器官纤维化发病机制具有重要启示。

研究结果

1.AT2 细胞中let-7d ( let-7afd )缺失会导致急性自发性肺损伤

为了解let-7在 AT2 细胞中的功能，构建了let-7afd条件性敲除小鼠。AT2细胞中let-7afd缺失导致动脉血氧饱和度（SpO2）降低（图 1a）。大约28%的let-7afd ^AT2小鼠出现了肺出血表型（图 1b、c ）。let -7afd ^AT2小鼠的肺泡腔内有弥漫性出血，并有免疫细胞浸润（图 1c）。他莫昔芬 (iTAM) 处理6 天后，对Sftpc-tdT⁺ AT2s进行转录组测序，发现细胞周期基因（如Mki67 ）、pAT2（如Hif1a）和 ADI/ADI-7（如 Cldn4、Ctgf）被诱导（图 1d-f）。iTAM处理14天后，let-7afd ^AT2小鼠肺中循环 AT2细胞增加（图 1g、h）。

对在AT2 维持培养基 (AMM)中生长的let-7afd ^AT2和对照 AT2 细胞衍生的类器官进行了菌落形成效率 (CFE) 测量和转录组测序（图 1i ）。let -7afd ^AT2细胞中的 CFE 和球体直径显著增加（图 1I、j、k）。GSEA 和GO富集分析显示let-7afd ^AT2类器官和Sftpc -tdT + AT2细胞在诱导细胞周期基因表达方面具有惊人的相似性（图 1l）。总之，这些数据表明let-7afd缺失会触发受损肺中 AT2 PSC 的不受控制的增殖扩增和 ADI 细胞的形成。

图1 AT2 细胞中let-7afd缺失会导致急性自发性肺损伤

2. AT2细胞中let-7 的靶标基因分析

为鉴定let-7靶点，通过AGO2 eCLIP富集let-7靶点 (图2a，b)。同时结合转录组数据进行一步缩小靶标基因范围，共筛选到394个靶基因（图 2f、g）。对let-7靶标基因进行功能富集分析，发现排名靠前的通路为癌症中的miRNA，ECM-受体相互作用和P53信号传导等（图 2h）。转录组和 ChIP-Seq分析显示，在 let-7afd 缺失后上调的基因中，MYC、E2F1、E2F6 和 BACH1 靶基因显著富集（图2i ）。在let-7afd缺失后，EZH2 靶基因在下调的基因中过表达（图 2i）。网络分析显示 EZH2 与中心靶点之间存在很强的连接性，暗示AT2 细胞中 存在let-7依赖的致癌 GRN (OGRN)(图2j )。在 14 天的 iTAM 之后，分选的let-7afd ^−/− Sftpc-tdT ⁺细胞中 OGRN 基因的 mRNA 表达显著增加（图 2m）。

采用scRNA-seq评估了博来霉素损伤后 AT2 细胞“桥接”到 ADI 过程中let-7靶标基因动态表达。有趣的是，Bach1、Ezh2、Kras、Myc和Nras表达水平沿着从 AT2 向 ADI 的分化轨迹增加（图 2n）。MHC-II ⁺Club细胞转化为 KRT8 + ADI 时， Ezh2和Bach1的表达模式更加微妙，表现为先增加后减少（图 2n）。许多let-7靶标基因相对于 AT2 和 MHC-II ⁺Club细胞而言，在 ADI 中的表达均呈现逐渐增加（图 2o）。let -7靶标基因在 AT1 细胞和过渡型 AT2 细胞中的富集程度高于 hAT2 细胞（图 2p）。总之，在肺损伤和应激诱导的 OGRN 上游肺泡再生后， let-7可影响 pAT2/ADI 的生成。

图2识别AT2 细胞中let-7靶组的靶标基因

3. let-7afd缺失会诱发自发性肺纤维化

在 iTAM 处理1 个月后，雄性和雌性let-7bc2 ^AT2和let-7afd ^AT2小鼠均表现出远端肺结构空间异质性破坏，如肺泡腔扩大、肺泡和支气管周围白细胞以及含铁血黄素的巨噬细胞浸润增加（图 3a-c）。此外，约 30% 的let-7afd ^AT2小鼠表现出肺泡异质性紊乱（图 3a、b）。let -7afd ^AT2小鼠还表现出肺泡隔破坏的孤立区域、成纤维细胞灶和胶原沉积，主要位于肺周围（图 3a、b、d、e）。

为了确定let-7基因簇的持续 Cre/loxP 缺失是否会在 1 个月内维持肺纤维化，let-7bc2 ^AT2和let-7afd ^AT2小鼠每月接受 iTAM 加强免疫，最长 6 个月。发现90% 以上的let-7afd ^AT2小鼠的肺部炎症、肺泡结构异质性破坏和纤维化表型持续长达 6 个月（图 3f-i）。对接受6个月 iTAM加强治疗的小鼠肺进行RNA测序，表明let-7afd ^AT2小鼠的肺组织中炎症和纤维化通路显著诱导。这些数据表明， AT2细胞中let-7afd的缺失可诱导自发性肺纤维化。

图3 let-7缺失会诱发自发性肺纤维化

4. let-7afd的消融刺激 ADI 细胞的持续存在

在let-7afd ^AT2小鼠中，受损区域中的 ADI 与间充质细胞扩增和肺泡破坏在空间上同时出现（图 4b、4c、d）。与对照组相比，let-7afd ^AT2小鼠中共表达 KRT8 或 CLDN4 的Sftpc-tdT ⁺标记细胞有所增加（图4e, f）。在 6 个月的iTAM 加强治疗后，let -7afd ^AT2小鼠的肺脏还表现出 ADI 和 ADI-7 细胞标志物的表达增加（图 4g, h）。

图4 let-7afd的消融刺激肺 ADI细胞的持续存在

5. let-7afd缺失导致AT2 细胞肥大并刺激促纤维化基因表达

TEM显示，let-7afd ^AT2小鼠的 AT2 细胞增大或肥大，面积增加 (图 5a, b )。值得注意的是，let-7afd ^−/− AT2 细胞的板层体 (LB) 数量和细胞总面积增加，且板层紊乱 (图 5a, b )。let-7 AT2靶标基因的通路注释揭示了一个功能上相互关联的互作网络，该网络由 50 多个靶标基因直接或间接参与 PI3K/AKT/MTOR 和 EMT 通路（图5c）。包括与纤维化相关的基因，如Myc，Itgb3，Plaur，Ctgf，Col5a2，Nras，Kras和Tpm1（图 5c）。另外，OGRN基因（如，Bach1，Ezh2）被纳入网络，它们分别在纤维化和PI3K / AKT / MTOR和EMT通路的起作用（图5c）。在患纤维化的 let-7afd ^AT2小鼠中，大多数OGRN基因在AT2细胞和肺中仍然上调（图5d、e）。此外，患纤维化的let-7afd ^AT2小鼠中BACH1 ⁺、EZH2 ⁺或MYC ⁺ Sftpc -tdT示踪细胞的数量有所增加（图 5f-i）。

图5 let-7afd缺失会刺激 AT2 细胞肥大，并诱导纤维化相关基因的表达

6. let-7afd缺失使 AT2 细胞易受 DNA 损伤、衰老和凋亡的影响

相关研究表明，在不同的肺损伤和纤维化模型中，AT2 细胞可能会经历与质量控制程序中断相关的细胞衰老和/或凋亡。let-7afd ^AT2小鼠中γH2AX ⁺ SFTPC ⁺和活性CASP3 ⁺ Sftpc- tdT +标记的AT2s的积累和频率显著增加（图6a-c）。此外，let-7afd ^AT2小鼠的肺实质中β-半乳糖苷酶底物X-gal大量积累，包括AT2s，表明广泛的细胞衰老程序被诱导（图 6d）。与这些结果一致的是，与对照组相比，let-7afd ^AT2小鼠分选的Sftpc- tdT细胞和整个肺脏表现出DNA修复、衰老、衰老相关分泌表型（SASP）和凋亡基因被诱导（图 6e、f）。

图6  let-7afd缺失与 AT2 细胞的 DNA 损伤、衰老和凋亡有关

为了确定let-7afd的缺失是否会抑制 AT2 向 AT1 细胞分化，比较了在 AT1 细胞分化培养基 (ADM) 中生长和let-7afd ^−/− AT2 细胞类器官中 IF 形成的 ADI 和 AT1 分化 (图 7a )。在 ADM 培养的第 7 天，let-7afd ^−/−类器官中的 CLDN4 ⁺和 KRT8 ⁺细胞和表达水平显著高于对照组，证实了let-7afd ^AT2小鼠肺中的 ADI 增加(图 7b、c )。let-7afd ^−/−类器官表现出 AGER ⁺、 HOPX ⁺、 AQP5 ⁺细胞和表达降低，进一步支持了AT1 的转分化异常 (图 7d-f )。值得注意的是，let-7afd ^−/−类器官还表现出表达降低和 LGALS3 ⁺（晚期 ADI 标记）细胞减少，表明 AT1 分化受到晚期阻滞（图 7d，g）。相比之下，let-7afd ^−/−类器官中的 SFTPC ⁺细胞和水平增强，表明let-7的缺失不仅促进了 ADI 的积累，而且加强了 AT2积累（图 7d，h）。有趣的是，let-7afd ^−/−培养的 AT2 类器官表现出更高的 BACH1 ⁺和 EZH2 ⁺细胞水平和频率（图 7d、i、j）。BACH1 和 EZH2 均与上皮细胞分化受损有关。对博来霉素诱导损伤的 scRNA-seq进行分析，随着 ADI 朝 AT1 细胞分化方向移动，BACH1/EZH2 和靶标基因的表达逐渐下降（图 7k）。综合起来，let-7afd缺失会阻碍 AT2 细胞“桥接”到 AT1 细胞，部分原因是可能是由 BACH1/EZH2 异位表达引起。

图7  let-7afd缺失会影响 AT2 到 AT1 的分化

7. Let-7afd通过H3K27表观遗传调控 AT2 纤维化重编程

使用CUT&RUN测序分析H3K27ac 和 H3K27me3的 修饰差异（图 8a）。在let-7afd ^−/− AT2 细胞中，观察到H3K27ac的peak相关基因显著富集在细胞周期（图 8b）。相反， H3K27me3 富集的相关基因主要与发育相关。将CUT&RUN-seq与转录组整合分析发现，let-7afd ^-/- AT2细胞中增强的H3K27ac修饰与let-7afd依赖性基因激活呈正相关（图 8d）。值得注意的是，H3K27ac修饰与let-7靶标基因（包括Bach1、Ezh2、Hif1a和Myc）呈正相关（图 8d,e）。此外，let-7afd ^−/− AT2 细胞中典型 ADI 细胞标记物（如Cldn4）显示 H3K27ac 修饰增加（图 8f） 。有趣的是，let-7afd的缺失还导致Sftpc和Bmp1的 H3K27ac 和 H3K27me3 共同修饰（图 8g ）。值得注意的是，EZH2、Bambi 43 和其他重要基因的抗纤维化和细胞生长抑制靶标在let-7afd ^{− /−} AT2 细胞中表现出 H3K27me3 沉积增加和表达降低（图8g）。let-7afd ^-/-类器官中的H3K27me3核表达水平显著增强（图 8h，i）。总之，这些数据强调了let-7afd在染色质重塑中的重要作用。

图8  let-7afd通过 H3K27表观遗传协调 AT2 纤维化重编程

8.let-7靶标基因在 IPF“异常基底样”（AB）细胞中富集

推测IPF 患者肺上皮细胞let-7活性降低可能导致基底样细胞（AB）的积聚。为了验证这一假设，分析了人 IPF 肺的单细胞 RNA 测序数据 。IPF AT2 中很少有 let-7靶点上调（图9a、b）。与 AT1 和 AT2 细胞相比 ，AB 细胞表现出小鼠let-7相互作用的显著富集（图9a、b）。此外， AB 细胞中上调的let-7靶点在包括 ECM 和 EMT 在内的纤维化途径中发挥重要作用（图 9c）。相比于 AT1 和 AT2 细胞，AB 细胞还表现出 EMT 基因的富集（图 9d）。let-7 靶基因ARID3A 、 BACH1 、 EZH2和NRAS在AB细胞中显著上调，而FOXP2和MYC则被抑制（图9e）。与IPF AT2细胞相比，AB细胞显示出更高的EZH2和BACH1表达（图 9f，g）。这些分析表明let-7 OGRN轴可能有助于IPF中AB细胞的形成；然而，还需要进一步验证。

图9  let-7靶标基因在 IPF“异常基底样”（AB）细胞中富集

原文链接：http://www.nature.com/articles/s41467-025-59641