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第一步：

从来源于健康成年贡献者的全血中，根据经典 SSC-A、FSC-A、SSC-A、FSC-H 和 FSC-A 门控对细胞的颗粒度、大小和黏连程度进行鉴定，先后排除了非细胞信号并保留单个活细胞信号样本。使用 CD45圈出所有白细胞，其中 CD15^Hi、CD66b^Hi的部分被定为中性粒细胞。

第二步：

外周血中性粒细胞在被激活之后会迁移到目标组织中，随后通过颗粒外排、吞噬或杀伤病原体发挥免疫调节能力，作者进一步根据多种细胞表面标记物的组合能够对中性粒细胞的血液亚型、上述能力以及一些罕见类型进行鉴定。CD177和OFLM-4两个标记物能够鉴定出多种外周血中性粒细胞亚型，如CD177^Hi和CD177^Lo中性粒细胞。CD11b和CD62L作为经典的细胞黏连分子对于中性粒细胞的迁移能力非常关键。初级和次级颗粒外排的能力分别可以被CD63和CD66b的表面表达量来评估。CD16协助中性粒细胞摄取调理颗粒（opsonized particles）进而发挥吞噬和杀伤的功能，实现免疫调节。除了正常工作的中性粒细胞之外，还会有一少部分会发生逆向迁移（Reverse-transmigration）或者造成过敏性表型，分别被表达CD54和CD49d所指征。

除此之外，作者还在中性粒细胞中鉴定到了一些具有特殊形态和功能的亚群，如带状、分叶核、超分叶CD16⁺CD62L⁺中性粒细胞，未成熟并免疫抑制CD10⁺中性粒细胞，CD16⁺CD63⁺GRIM（颗粒外排免疫调节和代谢增强）中性粒细胞。

第四步：

为检验这种门控分选策略在临床中应用的可靠程度。作者从三位健康贡献者外周血中纯化出大量中性粒细胞，使用不同感染情况的气道上皮培养基上清和健康人类唾液对纯化的中性粒细胞在体外进行刺激，使用上文中建立的门控策略对发生迁移的中性粒细胞进行门控分析。

作者对流式分选结果进行了UMAP降维可视化，中性粒细胞较好地被分成四群：WB（未经刺激的外周血中性粒细胞），Uninf（经未感染上清刺激的中性粒细胞），Psa（经铜绿假单胞菌感染上清刺激的中性粒细胞）和Saliva（经唾液刺激的中性粒细胞）。

作者进一步分析了经不同刺激物刺激后中性粒细胞亚群的多种标记物表达情况，如WB中性粒细胞有较高OLFM-4和CD62L的表达；Psa中性粒细胞高表达CD54和CD49d，即为前文中提及发生逆向迁移和过敏样表型的亚群。