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可复制型慢病毒RCL检测

可复制型慢病毒 RCL

生物药知识云享

08/21

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前言

Preface

文 l 特约推广 嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已成为一种非常有前景的抗癌免疫治疗方法。该方法包括对免疫细胞进行基因工程改造，使其表达CAR的表面受体，该受体能特异性靶向肿瘤细胞表面表达的抗原。在多种恶性肿瘤中，CAR-T细胞疗法已显示出在治疗化疗难治性患者方面的疗效。实际应用中，尽管载体被设计为具有复制缺陷，但载体生产过程中的重组事件可能会导致复制能力逆转录病毒（RCR）或复制能力慢病毒（RCL）的产生。在使用之前，必须仔细筛查载体，以确保患者不会无意中接触到RCR或RCL。这些风险导致监管机构要求在基因治疗产品治疗患者之前和之后对具有复制能力的病毒进行具体监测。

图1 CAR-T细胞免疫治疗主要过程示意图[1]

一、法规监管要求

基于安全因素考虑，中国国家药品监督管理局（NMPA）和美国美国食品药品监督管理局（FDA）均出台多项法规规范细胞及基因治疗药物研发、注册、临床、检测等工作，法规详见表1。

表1中美监管机构相关法规

法规名称	发布时间	发布机构
CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点	2018年6月	中国食品药品检定研究院
免疫细胞治疗产品临床试验技术指导原则（试行）	2021年2月	国家药品监督管理局药品审评中心
基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）	2021年11月
基因治疗产品长期随访临床研究技术指导原则（试行）	2021年12月
免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）	2022年5月
体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）	2022年5月
可复制型慢病毒检测共性问题与技术要求	2024年10月
Testing of Retroviral Vector-BasedHuman Gene Therapy Products forReplicationCompetent RetrovirusDuring ProductManufacture andPatient Follow-up	January 2020	U.S. Food and Drug AdministrationCenter for Biologics valuation and Research
Preclinical Assessment ofInvestigational Cellular and GeneTherapy Products	November 2013
Considerations for the Development OfChimeric Antigen Receptor (CAR) T cell Products	March 2022

《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》对复制型慢病毒（RCL）检测方法要求：建议采用指示细胞培养法对慢病毒载体进行 RCL 检测。对于 HIV 衍生的慢病毒载体，其 RCL 检测所用阳性对照可考虑使用满足检测要求的 HIV 病毒，如缺乏辅助基因的，同时具有复制能力的病毒，研究并评估阳性对照病毒的结构和制备方法，并在符合要求的环境中妥善操作和使用。 RCL检测指标方面，通常认为 p24 蛋白、逆转录酶活性、 psi-gag和 VSV-G 序列等的检出可反映 RCL 的存在，结合病毒载体具体情况和研究情况，选择合适的检测指标。

《可复制型慢病毒检测共性问题与技术要求》要求：为确保病毒载体阶段无 RCL 风险，建议每个临床试验用批次和商业化生产批次的病毒载体上清液和生产终末细胞均需要采用细胞培养法进行 RCL 检测。

二、RCL检测样本要求

图2 RCL检测样本需求[2]

《可复制型慢病毒检测共性问题与技术要求》与《Testing of Retroviral Vector-Based Human Gene Therapy Products for Replication Competent Retrovirus During Product Manufacture and Patient Follow-up》要求如下：

1、病毒载体上清液取样量：

根据早期使用逆转录病毒载体的经验（包括生产经验和临床使用经验），建议取至少 5%的未处理的病毒载体上清液进行 RCL 检测。但随着工艺优化及发展，以及临床使用经验的持续积累，推荐测试足够的病毒载体上清液，以确保取样量满足检出 1RCL/剂量的可能性为 95%。也可按照公式计算：

Vt=-（1/(1RCL/剂量当量)）ln(1-0.95)

其中 Vt 代表样品检测量。剂量当量：对于病毒载体直接作为体内基因治疗的产品定义为临床一次给药的最大剂量；对于体外基因修饰细胞产品，定义为病毒载体转导每个生产批次最大细胞量下使用的病毒载体的量。

2、生产终末细胞检测量

生产终末细胞指收获病毒载体上清液阶段分离的细胞或者多次收获病毒载体上清液最后获得的细胞。检测量通常按照总细胞量的 1%计算或 1× 10⁸个，以较小细胞量作为检测量。

3、患者监测要求

FDA建议监测计划包括在以下时间点对患者样本进行分析：治疗前，然后在治疗后的三个月、六个月和十二个月进行检测，并在十五年的时间内每年进行一次检测。如果任何治疗后患者样本呈阳性，应与CBER协商，进行进一步分析，并进行更广泛的患者随访。

三、RCL检测方法（细胞共培养法）

1、样本扩增培养

RCL扩增期培养：T细胞产物与C8166共孵育，通过3周（21天），经5次以上传代的共培养，将可能存在的RCL进行扩增，再进行检测。

RCL指示期培养：取扩增期的上清进行下一步的7天指示期培养，离心取细胞沉淀提取 DNA。采用原理不同的两种以上的检测方法，以防检测结果的假阳性。

2、实验分组

共培养阶段应设立合理的阳性对照组、阴性对照组和抑制对照组，并根据终点检测结果进行最终试验结果的判断。

3、阳性对照组病毒选择

我国监管部门法规对阳性对照病毒选择的要求为，满足 RCL 验证灵敏度要求的野生型HIV、减毒 HIV 或重组的条件复制型慢病毒载体作为阳性对照病毒，应确保阳性对照病毒的代表性。

图3 RCL测定示意图[3]

4、检测方法

（1）ELISA 法( p24 蛋白测定)

通过预先包被HIV-1核心抗体的96孔板在底物TMB以及过氧化根的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。

（2）Psi-gag序列区域的PCR法

重组形成psi-gag是形成RCL的关键步骤，通过常规PCR方法测定转移载体与包装载体发生同源重组形成的psi-gag 序列是RCL检测中的常规项目。该法基于gag序列的PCR方法具有灵敏度高、可重复的特性（灵敏度可达到1.6×10 copies/µL）。与P24检测互补可以防止内源性病毒基因组发生重组，形成不表达P24 蛋白的假病毒。

（3）VSV-G检测

研究人员利用水疱性口炎病毒G蛋白（VSV-G）替代HIV-1的env基因可以有效的降低RCL的风险。因此通过VSV-G 基因的特定病毒核酸序列的检测可以有效判断是否发生同源或非同源的病毒重组。

（4）逆转录酶活性（Pert）检测

逆转录酶是一种重要的酶，主要功能是从RNA模板合成互补DNA（cDNA）链，这是逆转录病毒复制周期中的一个关键步骤。该方法是一种常用于检测逆转录病毒的方法，其原理基于逆转录病毒的一个关键特性：它们都编码一个功能性的逆转录酶（RT）。

对指示期样品采用2种不同原理的检测方法以防止假阳性/假阴性的发生。

我公司可提供RCL检测服务，包含生产终末细胞EOPC、转导细胞以及病毒上清等，设置完善的对照体系，包括样品组、抑制对照组、阳性对照组、阴性对照组，与易感细胞C8166共培养后收集上清液，进行终点检测。

我公司建有生物安全三级（P3）实验室，能够开展HIV活病毒操作，支持采用HIV活病毒作为阳性对照组，可信度高，符合法规要求。此外自有P3实验室具有检测价格低，项目导入速度快等优势。

如您有相关需求，可以扫码添加微信联系我们~

参考文献

[1]Luo J, Zhang X. Challenges and innovations in CAR-T cell therapy: a comprehensive analysis. Front Oncol. 2024 Jun 11;14:1399544. doi: 10.3389/fonc.2024.1399544. PMID: 38919533; PMCID: PMC11196618.

[2]Cornetta K, Lin TY, Pellin D, Kohn DB. Meeting FDA Guidance recommendations for replication-competent virus and insertional oncogenesis testing. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022 Dec 2;28:28-39. doi: 10.1016/j.omtm.2022.11.009. PMID: 36588821; PMCID: PMC9791246.

[3]Cornetta K, Duffy L, Turtle CJ, Jensen M, Forman S, Binder-Scholl G, Fry T, Chew A, Maloney DG, June CH. Absence of Replication-Competent Lentivirus in the Clinic: Analysis of Infused T Cell Products. Mol Ther. 2018 Jan 3;26(1):280-288. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.09.008. Epub 2017 Sep 12. PMID: 28970045; PMCID: PMC5762981.

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