2025年3月24日，国际顶尖神经科学期刊“Neuron”发表了临港实验室联合中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心/神经科学研究所、华大生命科学研究院等单位完成的研究论文，题为“Single-cell spatial transcriptomic atlas of the whole mouse brain”。利用Stereo-seq空间转录组测序与单核RNA测序（snRNA-seq）技术，构建了具有单细胞分辨率的成年小鼠大脑图谱，为大脑功能的理解提供了全新视角。

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全基因组覆盖 + 空间单细胞分辨率：构建脑疾病研究的全脑“分子地图”

通过Stereo-seq空间转录组测序与单核RNA测序（snRNA-seq）联合应用，在全脑范围实现了单细胞级别、全基因组范围的表达图谱绘制。研究共采集123个小鼠脑冠状切片，覆盖整个左半球，共计获得超过420万个空间定位细胞、近3万个基因、308个细胞簇的高精度图谱。这不仅为脑区功能解读提供了基础“地形图”，更为寻找疾病易感区域与潜在干预靶点提供了前所未有的“坐标系”。

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脑区特异性细胞类型揭示神经疾病潜在靶点

研究发现在下边缘皮层区（ILA），深层谷氨酸能神经元与多种抑郁症相关基因高度相关；在帕金森病主要受损区域——中脑黑质（Substantia Nigra），进一步细分的多巴胺能神经元群体中，发现一类细胞群具有更高的帕金森病风险基因富集水平。这些新发现有望作为后续药物靶点研究和干预策略设计的突破口。

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基因表达驱动的大脑分区优化

借助高通量空间转录组数据，首次在全脑范围内系统评估了以基因表达特征为基础进行脑区划分的可行性与精度。研究通过空间聚类与差异表达分析方法，识别出多个具有显著转录组特征的功能亚区，一些脑区甚至可进一步细化为具有明确分子标记的子结构。此外，团队构建了覆盖不同脑区的基因模块图谱，揭示出各功能区在分子调控层面的高度特异性。

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解码脑发育轨迹中的分子调控网络

本研究还覆盖了从胚胎（E12.5）至成年（P77）七个发育关键阶段，通过对不同时期空间转录组数据的系统分析，识别出411个具有明显时间与空间变化趋势的转录因子调控网络（TF regulons）。这些调控网络在皮层、纹状体、丘脑等区域呈现出显著的前后轴或背腹轴表达梯度。例如，TFAP2C在胚胎期皮层高表达，调控放射状胶质细胞的命运决策；FOXO1则在纹状体发育后期激活。

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绘制非编码RNA空间动态图谱

首次在空间尺度上识别出513个具有脑区特异性的lncRNA，并揭示其在不同发育阶段的动态变化趋势。研究进一步构建了数千对lncRNA-mRNA共定位与互作网络，发现其中部分呈现明显的协同或拮抗表达模式，如Airn-Mas1、Gm13944-Zfp385b等，这些表达关系可能参与脑区特异性调控过程，为研究lncRNA与神经疾病的潜在关联提供了实验线索和转录组学依据。

通过Stereo-seq空间转录组测序与单核RNA测序（snRNA-seq）联合应用，在全脑范围实现了单细胞级别、全基因组范围的表达图谱绘制。共采集123个小鼠脑冠状切片，覆盖整个左半球，共计获得超过420万个空间定位细胞、近3万个基因、308个细胞簇的高精度图谱，覆盖了95.5%的注释蛋白编码和非编码基因（图1A）。共获得378,287个高质量细胞核，分为6个细胞类，19个亚类和308个簇(图1B和1C)。利用snRNA-seq数据集对空间转录组数据集进行空间细胞类型注释，发现沿前后轴的14个冠状面切片显示了不同细胞簇的空间分布（图1D）。特定的细胞簇表现出不同的区域偏好，如谷氨酸能神经元（glutamatergic neurons）主要分布于海马和皮质层（图1E），去甲肾上腺素能神经元（noradrenergic neurons）主要分布于蓝斑核（Locus Coeruleus）（图1F）。该研究构建了小鼠大脑中细胞类型分布的全面3D图谱，并开发了一个在线网站，以便于探索特定基因和细胞类型分布（http://mouse.digital-brain.cn/spatial-omics）。

图1  构建了一个高分辨率的小鼠脑细胞3D图谱

评估了308个细胞簇在小鼠大脑66个脑区的分布（图2A）。大多数神经元细胞群，表现出明显的区域偏好(图2A和2B)。谷氨酸能神经元中的31个细胞簇，与已发表的小鼠大脑皮质数据集高度重叠，并分为8个层特异性皮质细胞簇（图2C-2F）。此外，发现谷氨酸能神经元富集于特定的皮质区域（图2G、2H），如RSP的一个簇（L5/6_NP_GLU_61）和ILA的四个L6细胞簇（L6_N_GLU_63/ 65/66/69）（图2H、2I）。ILA细胞簇表现出抑郁相关基因的高表达，表明ILA L6神经元可能参与情绪障碍的功能调控。

尽管与神经元细胞相比，非神经元细胞分布更广泛，但一些细胞也表现出区域富集模式(图1B、2A)。在7个星形胶质细胞簇中，ASC_281 （Agt）富集于非端脑区，而ASC_283（Gdf10）则特异分布于小脑。进一步比较分析了嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）和星形胶质细胞（astrocyte，ASC）的空间分布（图2J和2K）。发现两个OEC集群（OEC_275/276）主要定位于副嗅球（accessory olfactory bulb，AOB）和主嗅球（main olfactory bulb，MOB）。同时，星形胶质细胞团ASC_279在MOB中富集（图2J）。在MOB及周边区域，ASC_279富集于肾小球层，而OEC_276富集于嗅神经层。相比之下，OEC_275位于这两层之间的边界（图2K）。这些簇的分子谱表现出明显差异，如Kctd12在OEC_275中高表达，Clca3a1在OEC_276中高表达，而Islr在ASC_279中高表达。进一步分析发现，ASC_279与两个神经元簇（OB_N_GABA_174和OB_ N_GLU_177）表现出更强的共定位，表明与OB神经元的相互作用更密切。

为了研究细胞类型和神经系统疾病之间的关系，对不同细胞簇进行基因集富集分析。两种多巴胺能簇（DIME_N_DOP_224/225）在帕金森病相关基因集中表现出不同程度的富集， DIME_N_DOP_225表现出更高的帕金森病相关基因表达，且主要集中在SN区。这些分布偏好可能与不同的大脑功能和神经系统疾病有关，为针对性治疗策略提供了宝贵的资源。

图2 小鼠脑内细胞簇的全脑分布

结合snRNA-seq和Stereo-seq数据，鉴定了23个神经元细胞簇，并发现了几种细胞类型的区域偏好。RH_N_GABA_257、RH_N_GLU_210、RH_N_GLU_240和RH_N_GLU_252分别局限于锥体核（NTB）、臂旁核（PB）、三叉神经主感觉核（PSV）和耳蜗核（CN）（图3A）。胆碱能神经元（RH_N_CHO_233）、去甲肾上腺素能神经元（RH_N_NOR_231）和血清素能神经元（RH_N_SER_ 229）分别富集于运动核、蓝斑核（LC）和中脑核(图3A和3B)。Stereo-seq数据揭示了三叉神经运动核(V)、面部运动核（VII）、舌下核（XII）和迷走神经背侧运动核（DMX）的高度异质性（图3C）。Nrgn、Ttr、Gal、Dag1等基因在特定的运动核中富集（图3D）。此外，不同中脑核的5-羟色胺能神经元也表现出选择性的基因表达模式（图3E和3F），突出了胆碱能神经元和5-羟色胺能神经元的基因表达多样性，具有不同的空间富集。

区域富集基因对脑干的生理功能至关重要，因此进一步鉴定出155个基因在23个脑干核中高表达（图3G）。Pth2和Sst在内侧肌旁核（MPL）中富集这些基因主要编码酶、受体相关蛋白和神经肽。合成去甲肾上腺素的Dbh在LC中高表达，而参与5 -羟色胺合成的Ddc和Tph2在RAmb中富集。酶相关基因如Plpp4、Dpysl3、Ache集中在DMX中。几种神经肽（Nmb、Nps、Pth2、Rln3和Ucn）在脑干中表现出区域富集。总之，提供了23个神经元细胞簇的图谱，并揭示了脑干中许多区域或亚区域中富集的基因。

图3 脑干神经元细胞簇中基因的特定空间分析

利用全脑空间转录组图，研究了大脑区域分割是否可以优化。最终得到了148个脑区，其中14个代表性脑切片与ABA CCFv3具有一致性（图4B）。基于转录特征定义的区域，如纹状体中的皮质、海马、丘脑和尾状壳核（CP），与ABA CCFv3的区域表现出高度重叠（图4C-4E）。此外，基于基因的大脑区域分割，8个大脑区域可以进一步划分为更精细的亚区域，如MOB和CP的肾小球层（MOBgl）、颗粒层（MOBgr）可进一步分为外侧和内侧区，而伏隔核（ACB）和下丘脑外侧区（LHA）则具有背侧和腹侧亚区。CA3锥体层（CA3sp）包含齿状回（DG）的近端和远端两个亚区。下丘沿其长轴排列有5层；脑桥中央灰色（PCG）可分为2段（图4F）。

为了探索不同大脑区域的共表达基因如何影响其功能，使用Hotspot鉴定具有相似空间模式的基因模块。在T74检测到50个模块，其中34个模块具有区域选择性（图4G）。以12个模块的分布为例，其中基因模块G22、G18、G5、G10、G38和G14在不同皮质层富集（图4H）。G26在梨状皮质（PIR）富集。值得注意的是，G9和G11分别在海马的阿蒙角区和DG区富集。基因模块在不同脑区或亚区的选择性同一性也被其代表基因的分布模式所证实（图4I）。GO分析显示，这些模块中的基因与其相应大脑区域的功能相关；如，G2（纤维束）中的基因与轴突鞘鞘有关，G6（下丘脑）中的基因与激素分泌有关。此外，在丘脑内3D发现了9个基因模块（图4K）。G1局限于内侧和外侧缰核（MH和LH），而其他G1分布在多个亚区（图4L和4M）。模块评分和基因表达模式表明，每个模块都有次区域偏好，这表明内侧和外侧丘脑之间存在不同的转录表达谱（图4M）。

图4 成年小鼠脑空间基因图谱

脑区域的形成是由一系列具有不同时空特征的TF和基因控制。收集了发育中的小鼠大脑从胚胎期到成年期的7个矢状切片的空间全转录组数据（图5A），包括E12.5、E14.5、E16.5、出生后第1天（P1）及P7、P14和P77。使用SCENIC，在7个发育阶段发现了998个TF。应用Hotspot，得到150个簇，每个簇包含一组空间共定位的TF调控子，每个簇内的调控都与不同的生物过程相关（图5B）。150个簇中有144个被发现定位于主要的大脑区域（图5C），这表明这些空间共定位的调控可能在大脑区域发育过程中协同。

在皮层中，68个TF调控在胚胎阶段表现出较高的活性，而76个在出生后阶段表现出较高的活性（图5D）。在纹状体中，发现52个TF调控在早期更为丰富，而56个在后期丰富（图5D）。在丘脑和小脑中发现了77和65个TF调控的类似模式（图5D）。发现胚胎皮层和发育中的嗅觉区域中大量存在TFAP2C（TFAP2C被认为是决定皮层径向胶质细胞命运的关键TF）。在纹状体中，PAX9在胚胎年龄时富集，而FOXO1在出生后发育过程中逐渐富集（图5E）。ATF4从表层逐渐向中层移动（图5F）。TBR1从浅层向深层转移，与第6层皮质神经元的提前成熟一致。NR2E1从深层向浅层转移（图5F），这与NR2E1在神经干细胞增殖中的重要功能及其对核上层完整性的关键作用是一致的。Lhx2在胚胎期（E12.5、E14.5和E16.5）沿喙尾轴表现出与Nfix相似的增加，但这种模式在产后期（P1、P7、P14和P77）减弱（图5G）。这与先前的报道一致，即Lhx2在E15.5阶段的梯度分布及其在桶状柱形成中的关键作用。这些TF和基因的梯度分布可能与确定皮层组织模式有关。

接下来，使用基因集富集评估了9个大脑区域和7个阶段中功能的动态变化。具体来说，与神经胶质瘤发生和突触成熟相关的基因在出生后阶段表现出更高的富集，而与神经母细胞增殖相关的基因在胚胎阶段表现出更高的富集。参与神经胶质瘤发生的基因在出生前后开始富集，并在P14时迅速达到峰值。有趣的是，我们发现纤维束和后脑中胶质形成相关基因的富集水平高于其他部位，这与最近关于人脑胶质形成的报道一致此外，参与突触成熟的基因在胚胎初期逐渐富集，并在出生后达到稳定状态。

图5 大脑发育过程中基因表达的时空分布

在哺乳动物基因组中，只有不到3%的基因组被转录成蛋白质编码转录物，而大多数是ncrna。在成年小鼠大脑Stereo-seq数据集中检测到5834个lncrna，其中513个lncrna显示区域富集(图6A)。Gm12688、Gm33651、6330420H09Rik、Gm20649、Hotairm1和Gm14033分别在嗅觉区、纹状体、海马、下丘脑、髓质和小脑中优先表达(图6B和6C)。37个lncrna在皮层呈层状富集分布（图6D），其中Gm26870、A830009L08Rik、1700047F07Rik、Gm11730和Gm28928分别富集于L1、L2/3、L4、L5和L6（图6E）。

已知一些lncrna对大脑发育至关重要。为了识别那些可能参与神经发育的lncrna，对E12.5至P77的Stereo-seq数据进行了分析，确定了216个跨发育阶段具有时空动态的lncrna（60个用于皮层，73个用于纹状体，30个用于丘脑，95个用于小脑）。A930024E05Rik在胚胎皮质高度丰富，而AC129186.1在出生后达到峰值（图6F和6G）。Gm2694已被证明调节小脑的突触稳定性，表明其在小脑发育中的潜在作用。这些发现表明，具有时空表达模式的lncrna可能在发育过程中大脑形态发生中发挥重要作用。功能富集分析发现早期模块（E12.5-E16.5）主要与神经元发育相关（图6H、6I），提示这些模块中的lncrna可能参与大脑发育。在后期阶段（P1-P77）开始富含与脑区域特异性功能相关的基因。例如，在纹状体中，36个lncrna与多巴胺受体信号通路相关（图6H和6I），而在皮层中，15个lncrna与突触成熟相关。总的来说，具有时空表达模式的lncrna可能对早期胚胎神经发育和后期神经功能有贡献。

研究进一步构建了数千对lncRNA-mRNA共定位与互作网络，发现其中部分呈现明显的协同或拮抗表达模式，如Airn-Mas1、Gm13944-Zfp385b等，这些表达关系可能参与脑区特异性调控过程，为研究lncRNA与神经疾病的潜在关联提供了实验线索和转录组学依据。

图6绘制非编码RNA空间动态图谱