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治疗性寡核苷酸的应用主要限制因素是寡核苷酸本身相对较大的分子和高负电的化学属性使其难有效的穿过细胞膜进入细胞而获得治疗浓度。多肽与寡核苷酸通过化学或生物连接而成的复合物称为肽-寡核苷酸偶联物（peptide oligonucleotide conjugate，POC）。这类分子结合了肽和寡核苷酸各自的特点，具有多种潜在的生物学功能和应用。POC可以提高治疗性寡核苷酸的细胞摄取、组织递送、生物利用度等，因此提高其整体效率。

关键词：治疗性寡核苷酸，细胞穿透肽，反义寡核苷酸，小干扰寡核苷酸，肽-寡核苷酸偶联物（POC），细胞摄取，药物递送，点击化学，中肽生化有限公司（CPC）

1、引言 Introduction

核酸药物的发现发展引领了继小分子药物、抗体药物后的第三次浪潮。特别是反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASOs）、小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）、适配体（aptamer）等寡核苷酸药物的兴起，引发了业界广泛的关注。

与传统药物相比，寡核苷酸药物具有高度特异性、高效性和持久性等多种优势。然而，由于寡核苷酸自身相对大的分子和带有负电荷等特殊化学属性使其很难进入细胞。为了克服这些限制、提高寡核苷酸的递送能力，将寡核苷酸与其他功能分子偶联形成复合物，目的在于改善细胞对寡核苷酸的摄取能力，提高组织对寡核苷酸的递送能力和生物利用度。例如，功能分子N-乙酰半乳糖胺（N-acetyl galactosamine, GalNAc）、亲脂性分子、多肽、小分子药物、抗体等。

治疗性寡核苷酸的临床应用起源于1998，FDA批准了第一个治疗巨细胞病毒诱导的艾滋病患者致盲性视网膜炎的反义寡核苷酸药物Fomivirsen。对RNA干扰机制的开创性研究，20年后第一款治疗性小干扰RNA出世，Patisiran (Onpattro)，一种治疗遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性的多发性神经病。自1998年第一款寡核苷酸药物上市截至2024年12月，全球共有21款寡核苷酸药物获批上市，其中13款ASO药物，6款siRNA药物和2款适配体，这些药物中约85.7%为2016年之后获批上市的。据最新报道，2024年至少有16款寡核苷酸1类新药在中国进入临床研究^[1]。

反义技术的出现，激发了人们对POC开发的兴趣。随后20世纪80年代末开始了对第一代治疗性寡核苷酸的开发。经过一段时间的研究，人们普遍认为，一种成功的核酸药物应该比迄今为止探索的大多数寡核苷酸化学成分表现出更好的细胞摄取能力。这种认识和理解与后来20世纪90年代中期被称为细胞穿透肽的偶然发现不谋而合^[2]。

尽管治疗性寡核苷酸及其类似物有着巨大的发展前景，但由于它们特殊的理化属性使其能有效的穿过细胞膜，通常是通过内吞的途径进入细胞。另一个问题是寡核苷酸大都不能透过血脑屏障而治疗神经退行性疾病。此外，除了需要通过外细胞膜，寡核苷酸必须从内涵体中逃逸出来并转移至细胞核。

为了克服寡核苷酸低下的细胞内吞能力的方法之一就是将寡核苷酸及其类似物与能提高细胞穿透能力的化合物偶联，如胆固醇和其他脂类、聚合物，特别是聚乙烯亚胺、树枝状大分子、无机纳米粒、DNA纳米结构等。尽管这些研究持续了25年之久，然而目前还没有一个稳定的方法将这些偶联物与寡核苷酸结合后用于大多数细胞和生物靶点以显著提高寡核苷酸的体内疗效^[2]。

20年前，细胞穿透肽（cell-penetrating peptide, CPPs）就被视为能递送寡核苷酸的最有前景的载体之一。由于CPPs能穿透细胞，并能介导非细胞穿透肽、蛋白质、纳米颗粒、量子点和核酸等分子的递送，因而CPPs逐渐成为能提高寡核苷酸在细胞，细胞室、组织和器官中浓度的有效工具。POC（peptide oligonucleotide conjugate，POC）被应用于各种医药领域，如抗菌、抗病毒、抗癌等^[3]。

2、肽-寡核苷酸偶联物 Peptide Oligonucleotide Conjugates, POCs

人们认为，寡核苷酸是通过受体介导的内吞作用进入细胞的。因此，这就需要治疗性寡核苷酸从内涵体中逃逸出来进入细胞质，触发小核酸干扰机制（RNAi），或者进入细胞核通过剪接而激活RNase H酶（反义机制）而发挥作用。在这个过程中，治疗性寡核苷酸会受到各种核酸外切酶和核酸内切酶的攻击而无法到达靶目标。

细胞穿透肽（cell-penetrating peptide, CPP ）通常是指5-40氨基酸的肽段。CPP通过能量依赖或非能量依赖机制进入细胞膜。此外，它还可以促进各种很难穿透细胞膜的分子的细胞内转运，如非细胞穿透肽，蛋白质，纳米粒或核酸。

1998年，一个名为penetratin（pAntp，16个氨基酸的短肽）的肽在体内成功的递送了一条21-mer的PNA（Peptide Nucleic Acid），完成了阻断丙氨酸受体的表达^[4]。一年后，Tat peptide 被使用在体内递送半乳糖苷酶^[5]。

根据理化性质，CPPs被主要分为3类。阳离子肽（cationic peptide），两亲性肽（amphipathic peptide）和疏水肽（hydrophobic peptide）。

2.1聚合阳离子细胞穿透肽（Polycationic CPPs）

这类肽主要是携带了正电荷的氨基酸残基，如精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、鸟氨酸（Orn）等。这些阳离子的肽可以被细胞有效的内化。阳离子穿透肽的代表是Tat 肽，它是一条富含精氨酸的序列RKKRRQRRR。研究显示，首先，富含Lys和His或Orn的肽被细胞吸收的效率低于富含Arg的肽^[6]。其次，Arg的数量不低于6个，但为了保证细胞有效的摄取，最佳的数量为8-10个^[7]。聚合阳离子穿透肽多来源于天然。

2.2  两亲性细胞穿透肽（A

mphipath

ic CPPs）

两亲性细胞穿透肽除了带正电荷的亲水区外，还含有以缬氨酸（valine）、亮氨酸（leucine）、异亮氨酸（isoleucine）和丙氨酸（alanine）^[8]。大多数两亲性细胞穿透肽是嵌合或合成的，也有一些来源于天然。两亲性细胞穿透肽分为三类：primary，secondary，和proline-rich CPPs。Primary细胞穿透肽是通过核定位信号（Nuclear Localization Signal, NLS）与疏水氨基酸组成的嵌合肽。NLS 是一个富含赖氨酸、精氨酸和脯氨酸的短链阳离子肽，它可以将偶联物通过核孔引导到细胞核。这类肽的代表为MPG肽^[9]和Pep-1^[10]。Secondary两性细胞穿透肽通常是一个α-螺旋构象，亲水性和疏水性的氨基酸排列在螺旋结构的两侧。如MAP（Model Amphipathic Peptide）, transportan或类似物TP-10等，由芳香色氨酸和阳离子精氨酸等组成。Proline-rich的两性细胞穿透肽是一类富含脯氨酸的肽，如人工合成的Bac 1-24，24个氨基酸的肽^[11-12]。

2.3疏水细胞穿透肽（Hydrophobic CPP）

疏水细胞穿透肽是由非极性或者低电荷的氨基酸组成。如C105Y肽和Pep-7。

3、中肽生化-POCs的偶联方法 The coupling method for CPC-POCs

自2021年CPC的寡核苷酸服务平台成立以来，基于多肽的优势，寡核苷酸平台专业人员努力研究和开发POC的制备工艺，并将此作为寡核苷酸服务平台的主要服务项目之一。

由于多肽和寡核苷酸化学合成的不兼容性 (chemical incompatibility)，通常是采用各自的固相合成法分别合成寡核苷酸和多肽片段，然后在液相中将两个片段偶联。

将寡核苷酸与多肽偶联的方法有巯基马来酰亚胺点击化学 (Thiol-maleimide click chemistry)、铜催化叠氮烷环加成点击化学 (copper-catalysed azido-alkyne cycloaddtion click chemistry, CuAAC) 和非铜催化的叠氮-DBCO烷环加成点击化学（azido-DBCO cycloaddition click chemistry）、二硫键 (Disulfide bond formation) 偶联等。

3.1 马来酰亚胺硫醇迈克尔加成 Michael-type addition of thiols to maleimides

在固相状态下分别合成寡核苷酸片段和肽片段。在固相状态下，寡核苷酸的5’-羟基偶联烷-NH2，然后按常规操作分别将寡核苷酸上和肽的保护基去除，并与载体分离。寡核苷酸和肽分别纯化后，寡核苷酸5’端的氨基上偶联一个马来酰亚胺酯，最后与多肽的SH偶联形成POC。如Fig. 1所示。

Fig. 1 马来酰亚胺偶联

a. 寡核苷酸上NH2-与N-Succinimidyl 3-Maleimidopropioniate偶联，再与带有巯基的肽偶联。b. 寡核苷酸上NH2-与Mal-PEG3 ester偶联后，再与带有巯基的肽偶联

3.2  1, 3偶极环加成反应1,3-dipolar cycloaddtion reaction

3.2.1 铜催化叠氮烷环加成点击化学 Copper-catalysed azido-alkyne cycloaddtion click chemistry

叠氮或炔基分别修饰寡核苷酸或肽，最后叠氮与炔基偶联形成POCs。如Fig. 2a 所示。

3.2.2 非铜催化的叠氮-DBCO烷环加成点击化学Azido-DBCO cycloaddition click chemistry

叠氮或DBCO可以任意修饰在寡核苷酸上或肽上，然后DBCO与叠氮偶联成POCs。如Fig.2b所示。

Fig. 2 叠氮偶联

a.叠氮修饰的肽与炔基修饰的寡核苷酸偶联；b. 叠氮修饰的肽与BCDO修饰的寡核苷酸偶联。

3.3 肽和寡核苷酸二硫键偶联 Disulfide-linked conjugates of peptide and oligonucleotide

3.3.1 Pys偶联法Pys coupling

寡核苷酸5’-端偶联Thiol-modifier-C6-disulfide后，用DTT还原成硫醇；肽N-端偶联Pys (PDEC)，然后最后通过亲和取代反应形成POC。如Fig. 3 所示。

Fig. 3 PDEC-多肽偶联法

3.3.2 Npys偶联法 Npys coupling

寡核苷酸5’端偶联Thiol-modifier-C6-disulfide后，用DTT还原成硫醇；肽N-端偶联Npys (DTNP)，然后通过亲核取代反应形成POC。如Fig. 4 所示。

Fig. 4 DTNP-多肽偶联法

3.4 环肽与寡核苷酸偶联的示例 An example for cycle-peptide and oligonucleotide which is hard to couple

由于位于寡核苷酸链中部T碱基上的炔基和环肽的空间位阻，使其反应活性降低，从而造成寡核苷酸和环肽的偶联十分困难。为了提高偶联效率，大大增加的催化剂Cu+，又造成其清除困难。CDMO五部的合成组全体人员经过数十次的试验、分析和改进后，成功的完成了高质量的产品。

3.4.1 寡核苷酸和环肽的结构

3.4.1.1寡核苷酸结构特点

在寡核苷酸链中，脱氧胸腺核苷酸的5-位修饰了炔基。见Fig. 5

Fig. 5 寡核苷酸结构

3.4.1.2环肽的结构特点

在环肽中，一个氨基酸上修饰了叠氮。见Fig. 6

Fig. 环肽结构

3.4.2 POC的结构

寡核苷酸上的炔基与环肽上的叠氮偶联形成POC。见Fig. 7

Fig. 7 POC 结构

3.4.3偶联特点

3.4.3.1乙炔基修饰的核苷酸

带有乙炔基修饰的核苷酸有两种，一是乙炔基未被保护的核苷酸，二是乙炔基被TIP保护的核苷酸，合成后需要单独去除。

未保护的乙炔基在碱性条件下，特别是加热，乙炔基很容易被水解形成甲基酮，因而阻碍了与肽的偶联。多次试验中我们也发现，氨解步骤是很难避免乙炔基不被水解，无论加热还是在室温反应。

乙炔基带有TIP保护的核苷酸单体虽然避免了水解的副产物，但需要氨解后用四丁基氟化铵（TBAF.3H2O）除去TIP。研究发现，尽管TBAF能有效的除去TIP（RT, 2h），但它的需要量非常大，寡核苷酸和TBAF的用量摩尔比超过1：5000。由于TBAF含有3个结晶水，用透析、反相色谱、离子交换色谱等方法均很难被清除干净，分子量分析显示，寡核苷酸上均带有13-15个TBAF。

3.4.3.2环肽

环肽中带有Phe（4-N3），为避免叠氮被破坏，切割液中酸的比例和反应条件均要温和。酸性太强，叠氮会被破坏，酸性太弱，氨基酸上的保护基很难被完全清除。

3.4.3.3 POC偶联

寡核苷酸与肽的比例远远大于常规的反应比例，Cu+作为催化剂浓度的大小可影响偶联效率，而且由于用量较大而使产品颜色偏蓝，需要通过多种分离手段才能有效的去除。POC与未被偶联的寡核苷酸在HPLC保留时间上相差无几。因此，如果寡核苷酸不被完全偶联的话，用反向色谱纯化很难达到有效的分离。

4、结论 Conclusion

尽管GalNAc作为寡核苷酸的递送载体已经是一个重大突破，受到了寡核苷酸开发人员的广泛认可和使用，但是特异性肝外靶向的递送，以及寡核苷酸的有效摄取仍具有挑战性。虽然对POCs的研究和开发非常具有前景，也有很多POCs进入了临床试验，但到目前为止，还未有一款POC进入市场。期待POCs的成功应用在短期内有所突破。

参考文献：

1.  邵丽竹，医药观澜，2024/12/3

2. Kristina Klabenkova et al. “Chemistry of Peptide-Oligonucleotide Conjugates: A Review.” Molecules, 2021, 26, 5420.

3. Anna. L et al. “Peptide-Oligonucleotide Conjugate: Chemistry and Therapeutic Applications.” Current Issues Mol. Biol. 2024, 46, 11031-11047.

4. Pooga, M. et al. “Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo.” Nat. Biotechnol. 1998, 16, 857-861.

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8. Zaro, J.L. et al. “Their structures and in vivo studies in drug delivery. Front. Chem. Sci. Eng. 2015, 9, 407-427.

9. Morris, M.C. et al. “A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells.” Nucleic Acid Res. 1997,  25, 2730-2736.

10.  Morris, M.C. et al. “A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.” Nat. Biotechnol. 2001, 19, 1173-1176.

11. Pujals, S. et al. “Proline-rich, amphipathic cell-penetrating peptides. Adv. Drug Deliv. Rev. 2008, 60, 473-484.

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